純化的 非復合的肉毒桿菌毒素在組合物中局部或通過注射施用，如美國專利申請No. 09/910,432 ; 10/793, 138 ;11/072, 026 ;11/073, 307, 11/824, 393和 12/154,982(它們通過引用整體并入 本文）所描述的。
[0080] 在某些實施方案中，包含非復合的肉毒桿菌毒素的硫酸銨懸浮液的組合物可容易 地混合到藥物組合物中。例如，包含非復合的肉毒桿菌毒素蛋白的硫酸銨懸浮液可以被離 心，以回收蛋白，且蛋白可以再溶解、稀釋和與一種或多種藥學上可接受的賦形劑混合。在 某些實施方案中，藥物組合物可包含非復合的肉毒桿菌毒素作為活性藥物成分，并還可包 含一種或多種緩沖劑、載體、穩定劑、防腐劑和/或填充劑。藥物組合物可以被凍干成粉末 用于儲存，和被重構以進一步使用。因此，本文描述的方法和系統可提供在易于制備方面特 別適合于藥物應用的形式的肉毒桿菌毒素。
[0081] 藥物組合物可用于治療性、診斷性、研宄性和/或美容性應用。例如，如上文 所討論的，A型肉毒桿菌毒素在臨床上用于治療以骨骼肌活動過度為特征的神經肌肉障 礙，諸如自發性瞼痙攣、斜視、頸部肌張力障礙和眉間紋（面部）皺紋。此外，在某些應 用中，非復合的（約150kD)肉毒桿菌毒素是用于治療人類的優選形式。參見例如Kohl A.等人 Comparison of the effect of botulinum toxin A (Botox?) with the highly-purified neurotoxin (NT 201)in the extensor digitorum brevis muscle test (肉毒桿菌毒素 A (B〇t〇X?)與高度純化的神經毒素 （NT 201)在趾短伸肌試驗中的 效力的比較），Mov Disord 2000;15(增刊3):165。因此，不同于肉毒桿菌毒素復合物，優 選地使用非復合的肉毒桿菌毒素來制備某些肉毒桿菌毒素藥物組合物。 實施例
[0082] 實施例1 :本發明的方法與改進的Schantz方法的對比
[0083] 將使用本發明范圍內的方法的非復合的A型肉毒桿菌毒素的純化（"本發明的方 法"）直接對比基于傳統的Schantz方法，且通過加入色譜步驟（以提供非復合形式）而進 一步改進的純化（"改進的Schantz方法"）。簡而言之，培養肉毒梭菌細菌，并使之生長， 直到發酵完成（從接種到收獲，通常約72小時至約120小時）。然后，在以下純化程序的每 一個中，使用30L體積的發酵培養物。
[0084] 所使用的改進的Schantz方法包括，常規地酸化發酵培養物以沉淀毒素，隨后超 微過濾（UF)和滲濾（DF)以濃縮粗制毒素。將DNA酶和RNA酶加入到收獲的毒素中以消 化（水解）核酸，然后通過另外的UF步驟，使用切向流過濾（300kD UF)將核酸除去。隨 后，毒素用磷酸鹽緩沖液提取，隨后是三個連續的沉淀步驟：冷乙醇沉淀；鹽酸沉淀和硫酸 銨沉淀；其中每次通常棄去上清液。該程序提供了 900kD A型肉毒桿菌毒素復合物，然后 其經受額外的色譜步驟以提供游離毒素。具體地，將毒素復合物再溶解，并經受陰性成批吸 附（negative batch adsorption)到DEAE樹脂上。然后，洗脫液在重力流動陰離子交換柱 (DEAE-Sepharose)上運行，隨后是重力流動陽離子交換柱（CM-Sepharose)。測定產量，記 錄該方法花費的時間長度（不計算發酵時間），并通過SDS-PAGE分析測量純化的非復合的 A型肉毒桿菌毒素的純度，并通過例如本領域技術人員已知的技術測定其效價。整個改進的 Schantz方法重復三個不同批次（批號1、2和3)，且結果記錄在以下的表1中。
[0085] 根據本文描述的系統和方法，本發明的方法進行三個不同批次（批號4、5和6)。簡 而言之，發酵培養物在低于25°C的溫度下經受使用3M硫酸（將pH降至3. 5)的酸沉淀。然 后，酸沉淀物經受〇. 1 μ m切向流過濾以濃縮細胞物質。然后，將pH調整至6，并加入核酸酶 以減少宿主細胞核酸含量，隨后離心凈化以除去細胞碎片，并加入硫酸銨以〇. 2 μπι死端過 濾。然后，將濾液直接裝載至疏水相互作用柱，苯基瓊脂糖HP (GE Life Sciences)，用下降 梯度的硫酸銨洗脫，并分離產物峰。然后，將洗脫液稀釋至Tris緩沖液pH 7. 8中，以解離毒 素復合物，然后將其裝載到陰離子交換柱Q XL瓊脂糖（GE Lifesciences)上，用上升梯度 的氯化鈉洗脫，并再次收集產物峰。然后，將該洗脫液在磷酸鈉緩沖液中稀釋（以減少導電 率）并裝載到陰離子交換柱Q XL瓊脂糖（對于批號4和5)或陽離子交換柱Source-S (GE Life Sciences)(對于批號6)上，再次用上升梯度的氯化鈉洗脫，并收集和儲存最終的產 物峰。該方法產生非復合的A型肉毒桿菌毒素。測定產量，記錄該方法花費的時間長度（不 計算發酵時間），并通過SDS-PAGE分析測量毒素的純度，并例如通過本領域技術人員已知 的技術測定其效價。結果也記錄在以下的表1中。
[0086] 表 1
[0087]
[0088] 如表1所示，在改進的Schantz方法中存在關于批號2的批次失敗。失敗的全部 批次給予〇產量。還存在關于批號3的部分批次失敗。失敗出現在鹽酸沉淀步驟，但是一 些產物從通常棄去的上清液中挽救回來。挽救的產物用一個偏離步驟再次處理，結果是觀 察到的與批號1相比的降低的產量（4mg相比于Ilmg)和觀察到的與批號1相比的降低的 效價（173LD50單位/ng相比于255LD50單位/ng)。
[0089] 關于使用本發明的方法的批次，由于色譜系統的失敗，包括柱的高度鹽洗滌，批 號4相比于例如批號5顯示出降低的產量（43mg相比于99mg)。因為失敗，一部分毒素過 快洗脫，導致觀察到的降低的產量，但還是具有觀察到的較高純度（98. 6%的純度相比于 95. 3 %的純度）。
[0090] 批號6顯示本發明的方法和系統的高度優選的實施方案的結果，其中在第三色譜 步驟中使用陽離子交換柱。如表1所示，這一實施方案產生例如與批號5相比提高的純度 (100%純度相比于95.3%純度），并保持了高產量（891^相比于9911^)和高效價（2500)50 單位/ng相比于252LD50單位/ng)。
[0091] 還如表1所示，在本發明的優選實施方案中，縮短了純化的總長度。例如，批號6 在僅4天內純化，相比之下，使用在常規Schantz方法之后包括三個額外色譜步驟的改進的 Schantz方法來純化非復合的肉毒桿菌毒素花費了 10天。
[0092] 該結果表明，本文教導的方法和系統可用于以高效價和純度制備高產量的非復合 的肉毒桿菌毒素，并且表明，本文描述的方法和系統可用于大規模有效純化適合用作例如 藥物組合物中的活性成分的非復合的肉毒桿菌毒素。
[0093] 本文引用的所有參考文獻，包括專利申請和出版物，通過引用以其整體并入本文 并且用于所有目的，其程度如同具體地和單獨地指出，每個單獨的出版物或專利或專利申 請通過引用以其整體并入本文用于所有目的。如對本領域技術人員而言是顯然的，可對本 發明進行許多改進和變化，而不偏離本發明的精神和范圍。本文描述的具體實施方案僅通 過舉例的方式提供，并且本發明僅由所附權利要求的范圍以及這些權利要求賦予的等價物 的全部范圍來限制。
【主權項】
1. 一種用于純化非復合的肉毒桿菌毒素的方法，所述方法包括： (i) 提供粗制的非復合的肉毒桿菌毒素； (ii) 將所述粗制的非復合的肉毒桿菌毒素裝載到陰離子交換柱上，以允許通過所述陰 離子交換柱俘獲所述非復合的肉毒桿菌毒素； (iii) 從所述陰離子交換柱洗脫所述非復合的肉毒桿菌毒素，以得到包含所述非復合 的肉毒桿菌毒素的洗脫液； (iv) 用來自所述陰離子交換柱的所述洗脫液裝載陽離子交換柱，以允許通過所述陽離 子交換柱俘獲所述非復合的肉毒桿菌毒素；和 (V)從所述陽離子交換柱洗脫純化的非復合的肉毒桿菌毒素。2. 根據權利要求1所述的方法，其中所述粗制的非復合的肉毒桿菌毒素通過以下獲 得： 獲得包含肉毒桿菌毒素復合物的樣品； 用所述樣品裝載疏水相互作用柱，以允許通過所述疏水相互作用柱俘獲所述肉毒桿菌 毒素復合物； 從所述疏水相互作用色譜柱洗脫所述肉毒桿菌毒素復合物；和 解離所述肉毒桿菌毒素復合物，以獲得包含所述粗制的非復合的肉毒桿菌毒素的混合 物。3. 根據權利要求2所述的方法，其中所述樣品是包含所述肉毒桿菌毒素復合物的上清 液或濾液。4. 根據權利要求2所述的方法，其中所述樣品通過以下獲得： 使包含肉毒桿菌毒素的發酵培養物經受酸沉淀，以得到酸沉淀物；和 對所述沉淀物進行切向流過濾以濃縮沉淀物。5. 根據權利要求2所述的方法，其中所述樣品通過下列來獲得：使發酵培養物的不溶 性級分經受切向流過濾。6. 根據權利要求2所述的方法，其中所述樣品在裝載至所述疏水相互作用柱之前，經 受核酸酶消化。7. 根據權利要求6所述的方法，其中所述核酸酶源自不含動物產物的過程。8. 根據權利要求1所述的方法，其中所述方法基本上不含動物產物。9. 根據權利要求1所述的方法，其中所述純化的非復合的肉毒桿菌毒素包括A、B、C p D、F、F和G型肉毒桿菌毒素中的至少一種。10. 根據權利要求1所述的方法，其中所述純化的非復合的肉毒桿菌毒素包括A型肉毒 桿菌毒素。11. 根據權利要求1所述的方法，其中所述純化的非復合的肉毒桿菌毒素是至少95% 純的。12. 根據權利要求1所述的方法，其中所述純化的非復合的肉毒桿菌毒素具有至少 200LD5(I單位/ng的活性。13. 根據權利要求1所述的方法，其中所述方法產生至少約2mg/L發酵培養物的產量。14. 根據權利要求1所述的方法，其中所述陰離子柱選自Q瓊脂糖HP柱、Q瓊脂糖快流 柱和Q XL瓊脂糖柱，且其中所述陽離子柱選自SP瓊脂糖柱、SP瓊脂糖HP柱、SP瓊脂糖快 流柱、Mono S 柱、Source-S 柱、Source_30S 柱和 Source_15S 柱。15. 根據權利要求1所述的方法，其中用于將所述非復合的肉毒桿菌毒素裝載到所述 陰離子柱上的緩沖液選自Tris、bis-Tris、三乙醇胺和N-甲基二乙醇胺。16. 根據權利要求15所述的方法，其中所述緩沖液在7. 4至8. 2的pH下使用。17. 根據權利要求1所述的方法，其中用于將所述非復合的肉毒桿菌毒素裝載到所述 陽離子柱上的緩沖液選自：磷酸鈉、MES和HEPES。18. 根據權利要求17所述的方法，其中所述緩沖液在6. O至7. O的pH下使用。19. 根據權利要求1所述的方法，其中所述陰離子柱的pH是7. 4至8. 2。20. 根據權利要求1所述的方法，其中所述陽離子柱的pH是6. O至7. 0。21. 根據權利要求1所述的方法，其中用于將所述非復合的肉毒桿菌毒素從所述陰離 子柱洗脫的梯度選自氯化鈉的上升梯度和氯化鉀的上升梯度。22. 根據權利要求21所述的方法，其中所述梯度在7. 4至8. 4的pH下使用。23. 根據權利要求1所述的方法，其中用于將所述非復合的肉毒桿菌毒素從所述陽離 子柱洗脫的梯度選自氯化鈉的上升梯度和氯化鉀的上升梯度。24. 根據權利要求23所述的方法，其中所述梯度在6. 0至7. 0的pH下使用。
【專利摘要】提供了用于色譜純化肉毒桿菌神經毒素的方法和系統。這些方法和系統允許以高純度和產量有效純化非復合形式的肉毒桿菌神經毒素，所述非復合形式的肉毒桿菌神經毒素可在藥物制劑中用作活性成分。
【IPC分類】C07K1/34, C07K1/36, C07K1/18, C07K1/30, C07K1/20, C07K14/33
【公開號】CN104961812
【申請號】CN201510173705
【發明人】C·L·魯格
【申請人】雷文斯治療公司
【公開日】2015年10月7日
【申請日】2010年10月20日
【公告號】CA2773396A1, CN102666396A, CN102666396B, EP2490986A1, EP2490986A4, US20110092682, US20120196349, US20150322419, WO2011050072A1