物。在一些特別優選的實施方案中，約3M硫酸溶液可以 被加入到發酵培養物中，以形成酸沉淀物。優選地，將pH降低至約3至約4,更優選降低至 約3. 2至約3. 8,且更優選約3. 5。在一些實施方案中，培養溫度也被降低，例如降低至低于 約25°C、24°C、23°C、22°C、21°C或20°C。這些條件還增強了肉毒桿菌毒素復合物與細胞碎 片的締合。形成的酸沉淀物將包括結合的肉毒桿菌毒素復合物，并可在進一步的純化步驟 (諸如凈化步驟）中用作起始材料；而棄去濾液。
[0044] 相反，圖IB中描述的常規過程不包括酸沉淀步驟。即，雖然純化程序也開始于包 含肉毒桿菌毒素復合物的發酵培養物，但培養基經受深度過濾，且在隨后的純化步驟中使 用濾液而不是細胞碎片。在圖IB的過程中，棄去了細胞碎片而不是濾液，而如圖IA所示， 棄去了濾液，且將細胞碎片（酸沉淀物）用于進一步的純化步驟，例如以下討論的色譜前純 化。
[0045] 色譜前純化
[0046] 在一些實施方案中，從發酵培養基獲得的樣品經受一種或多種色譜前純化。色譜 前純化可包括切向流過濾、核酸酶消化和凈化離心和/或過濾中的至少一種。圖IA提供了 本發明涵蓋的包含色譜前純化的工藝流程的一個非限制性實例。如上所示，在優選的實施 方案中，對包含肉毒桿菌毒素的發酵培養物的沉淀物（或不溶性級分）而不是對發酵培養 物自身或源自其的濾液（如圖IB所示的過程）進行色譜前程序。即，在本發明的優選實施 方案中，色譜前（凈化）步驟起始于酸沉淀物（不溶性級分）。
[0047] 在一些實施方案中，包含肉毒桿菌毒素的樣品（酸沉淀物或不溶性級分）經受切 向流過濾。切向流過濾是通常用于凈化、濃縮和/或純化蛋白的過程。與正常流動過濾（其 中液體在施加的壓力下直接朝向濾膜移動）相反，在切向流過濾中，液體沿著膜表面切向 地或平行地移動。施加的壓力用于迫使一部分液體通過濾膜，達到濾液側，而太大而不能通 過膜孔的顆粒和大分子被滯留下來。然而，不同于正常流動過濾，滯留的組分沒有滯留在膜 表面，而是被切向流動的液體清掃。在某些優選的實施方案中，切向流過濾用于濃縮與肉毒 桿菌復合物締合的不溶物質（細胞碎片），同時允許濾液通過膜孔。（參見例如圖1A)。切 向流過濾參數，諸如孔徑、進料流量、施加的壓力等等可由本領域技術人員選擇以濃縮細胞 碎片，并產生更濃的含肉毒桿菌毒素復合物的樣品。在一些特別優選的實施方案中，例如， 可使用切向流過濾，其使用具有約〇. 1 μπι的孔徑的濾器。
[0048] 在一些實施方案中，包含肉毒桿菌毒素的樣品經受核酸酶消化。核酸酶消化可促 進肉毒桿菌毒素復合物易于與其結合的核酸組分的去除。在某些優選的實施方案中，核酸 酶消化在切向流過濾之后，并對由切向流過濾獲得的濃縮的細胞碎片進行。（參見例如圖 1Α)。例如，濃縮的細胞碎片樣品的pH可被調整以提供核酸酶活性，并可用一種或多種合適 的核酸酶進行孵育，所述核酸酶諸如分別消化（水解）DNA和/或RNA的DNA酶和/或RNA 酶。依賴于所用的核酸酶，合適的pH可以是約5至約7,優選地約6。在一些實施方案中， 苯甲脒被用作蛋白酶抑制劑，以防止核酸酶消化步驟期間毒素的蛋白酶解。使用的核酸酶 可源自任何適合的來源，包括動物源和/或非動物源。
[0049] 在更加優選的實施方案中，核酸酶由非動物源獲得，以提供不含動物產物的核酸 酶和不含動物產物的過程。因此，本發明涵蓋用于純化肉毒桿菌毒素的不含動物產物的方 法和系統（或基本上或大體上不含動物產物的方法和系統），其包括使用核酸酶。不含動物 產物的核酸酶可重組制備，例如使用重組細菌、酵母或其他合適的微生物，所述重組細菌、 酵母或微生物已經被轉化而表達根據本文描述的方法的核酸酶消化步驟中使用的DNA酶 和/或RNA酶。核酸酶消化通常減少樣品的核酸含量，因為宿主細胞的核酸被降解，并且促 進了它們的去除。例如，水解的核酸和其他低分子量雜質可通過進一步的純化步驟除去。
[0050] 在某些實施方案中，包含肉毒桿菌毒素的樣品可經受凈化離心和/或過濾。凈化 離心或過濾指用于從樣品中除去肉眼可見的成分（gross element)，諸如完整的和溶解的 細胞和細胞碎片，產生可測量地更澄清的樣品的離心或過濾步驟。在某些實施方案中，離 心以約10, OOOxg至約30, OOOxg，更優選地以約15, OOOxg至約20, OOOxg，且最優選地以約 17, 700xg進行。凈化過濾將通常包括正常流動過濾，也稱為"死端"過濾，其中液體在施加 的壓力下直接朝向過濾介質移動，并且太大而不能通過濾孔的顆粒積累在表面或在介質自 身中，同時較小的分子作為濾液通過。在一些特別優選的實施方案中，將樣品與硫酸銨混 合，并且正常流動過濾使用具有約0. 1至約0. 3 μ m的孔徑，且更優選地約0. 2 μ m的孔徑的 濾器進行。（參見例如圖1A)。在某些特別優選的實施方案中，一個或多個凈化步驟跟隨核 酸酶消化步驟。在某些更加優選的實施方案中，一個或多個凈化步驟緊在色譜純化之前進 行。
[0051] 值得注意的是，在優選的實施方案中，凈化的上清液或濾液（而不是被棄去的不 溶性級分）提供了用于進一步的純化步驟（諸如色譜純化步驟）的含肉毒桿菌毒素的樣 品。這與圖IB中描述的過程相反，其中肉毒桿菌毒素復合物包含在來自不包括酸沉淀的色 譜前步驟的不溶性級分中，諸如例如從色譜前離心獲得的離心團塊，并且棄去上清液。
[0052] 此外，并且再次與圖IB中描述的過程相反，在本發明的一些實施方案中，色譜前 步驟不需要從發酵培養物獲得的濾液的切向流過濾步驟。即，在本發明的一些實施方案中， 色譜純化所用的樣品不是通過使發酵培養物的可溶性級分經受切向流過濾來獲得的。而 是，在某些實施方案中，本發明使用不溶性物質（諸如酸沉淀物），消除了其中使發酵培養 物濾液經受切向流過濾以試圖濃縮可溶的肉毒桿菌毒素復合物的任何步驟。因此，在優選 的實施方案中，本發明的色譜前步驟消除了對任何此類步驟的需要，作為代替，使用酸來沉 淀所需的毒素復合物和其他不溶性物質（細胞碎片）。
[0053] 色譜純化步驟
[0054] 圖IA還闡釋了根據本發明的某些實施方案的色譜純化步驟。根據本發明的一個 實施方案，用于純化非復合的肉毒桿菌毒素的色譜方法包括，使包含肉毒桿菌毒素的樣品 通過多個色譜柱，以獲得高度純化的、高效價的、非復合形式的神經毒素。
[0055] 在某些實施方案中，使用疏水相互作用柱將復合的肉毒桿菌毒素與其他細胞組分 分離（參見例如圖1A)。該柱俘獲復合形式的肉毒桿菌毒素，同時允許雜質流過該柱。所 用的柱可以是本領域已知的、適合用于這種目的的任何疏水相互作用柱，諸如商購自GE Healthcare Life Sciences 的丁基瓊脂糖快流（Butyl Sepharose Fast Flow)柱或苯基瓊 脂糖HP (Phenyl Sepharose HP)。在一些實施方案中，該方法還包括在裝載到柱上之前，處 理用于疏水相互作用色譜的樣品。例如，當用于苯基瓊脂糖HP柱時，樣品可在裝載前與pH 6的0. 5M硫酸銨溶液和50mM磷酸鹽合并。可以使用的其他的柱、緩沖液和pH條件包括柱， 諸如苯基瓊脂糖快流高置換（Phenyl Sepharose Fast Flow high substitution)、苯基瓊 脂糖快流低置換（Phenyl Sepharose Fast Flow low substitution)、丁基瓊脂糖（Butyl Sepharose)和辛基瓊脂糖（Octyl Sepharose);緩沖液，諸如乙酸鹽、朽1檬酸鹽、MES、組氨 酸、哌嗪和丙二酸鹽，各自的pH范圍是約4. 0至約7. 0,更優選地約4. 5至約6. 5,且更加優 選地約5. 5。如本領域所知的，基于本文提供的教導，可確定其他緩沖液和pH條件以使所使 用的特定柱的收率最大化。不期望受到理論的束縛，認為分離包括在低于7的pH下使毒素 復合物結合于樹脂以避免在該步驟解離，同時允許許多細胞源雜質流過，諸如例如較小的 蛋白、核酸等等。
[0056] 如本領域所知的，為了將俘獲的（結合的）毒素從疏水相互作用柱洗脫，可使用合 適的緩沖液。在一些特別優選的實施方案中，使用下降梯度的硫酸銨。下降梯度的濃度范圍 可以是約0. 6M至約0. 0M、約0. 5M至約0.0 M或約0. 4M至約0. 0M。可使用的其他洗脫緩沖 液包括例如，下降梯度的硫酸鈉（Na2SO4);氯化鈉（NaCl);氯化鉀（KCl);乙酸銨（NH 4OAc) 等等。如本領域所知的，可鑒別包含產物峰的級分。例如，當使用硫酸銨時，通常在約0.4M 至約0.0 M ;更優選地約0. 3M至約0.0 M ;且最優選地約0. 25M至約0.0 M硫酸銨的濃度范圍 內發現峰級分，同時將PH保持在約6以維持復合物。即，可鑒別并在隨后的純化步驟中使 用含有洗脫的肉毒桿菌毒素復合物的級分。
[0057] 在優選的實施方案中，使所得的肉毒桿菌毒素復合物解離，以得到非復合形式。在 某些優選實施方案中，解離步驟在疏水相互作用色譜步驟之后和/或在隨后的色譜步驟之 前進行（例如參見圖1A)。因此，在一些優選的實施方案中，本發明涵蓋了其中色譜的目標 分子在不同的色譜步驟中不同的方法和系統。即，在初始的色譜步驟中，目標包括肉毒桿菌 毒素復合物，而在隨后的色譜步驟中，目標包括從非毒素蛋白（諸如血凝素和非血凝素蛋 白）解離的游離的肉毒桿菌毒素。相反，在圖IB中描述的過程包括全部設計用于純化肉毒 桿菌毒素復合物的色譜步驟。
[0058] 解離肉毒桿菌毒素復合物以產生非復合的肉毒桿菌毒素蛋白可以以許多方式完 成，例如，如本領域所知的和/或本文描述的。例如，可通過將pH升高至約7.0完成解離； 或在其中不含動物蛋白的純化不是必須的實施方案中，可通過在約7. 3的pH下用紅細胞處 理復合物完成解離。
[0059] 在優選的實施方案中且為了提供不含動物的毒素，基于復合物在合適的緩沖液中 的pH調整，使復合物經受分離過程。合適的緩沖液包括但不限于陽離子緩沖液，優選地不 與陰離子交換柱相互作用，或基本上不與陰離子交換柱相互作用的陽離子緩沖液。合適的 陽離子緩沖液包括例如，Tris、bis-Tris、三乙醇胺、N-甲基二乙醇胺。約7至約8. 4之間 的PH ;更優選地約7. 4至約8. 2之間的pH ;且最優選地約7. 8的pH通常適合于解離復合物 以釋放非復合的肉毒桿菌毒素。在一些特別優選的實施方案中，將疏水相互作用柱的洗脫 液的pH升至約7. 5、約7. 8或優選地升至約8. 0。例如，在一些實施方案中，洗脫液可被稀 釋到具有約7. 8的pH的Tris緩沖液中，以使復合物解離成單獨的組分，包括約150kD非復 合的肉毒桿菌毒素蛋白。然后，包含解離組分的所得混合物可經受一個或多個額外的色譜 純化步驟，諸如設計用于俘獲并進一步純化非復合的毒素的離子交換色譜步驟。
[0060] 在根據本發明的某些實施方案中，可使用一個或多個離子交換色譜步驟純化非復 合的肉毒桿菌毒素（例如參見圖1A)。離子交換色譜實現基于靜電荷的分級分離。給定的 蛋白結合柱基質的程度是蛋白的靜電荷的函數，蛋白的靜電荷基于其氨基酸組成和柱基質 的電荷。陽離子離子交換柱具有帶凈正電荷的基質，而陰離子離子交換柱具有帶凈負電荷 的基質。使用含帶電物質的溶劑（洗脫劑）從柱上選擇性地洗脫結合的蛋白，所述帶電物 質諸如鹽離子，其與帶電的基質支持體競爭與帶電的蛋白的結合。因此，結合的蛋白可基于 它們的電荷強度分級分離。可選擇地，可通過調節PH(其可改變蛋白的靜電荷），由此改變 蛋白對帶電基質的親和力來洗脫蛋白。
[0061] 在根據本發明的一些優選的實施方案中，將包含非復合的肉毒桿菌毒素的混合物 裝載到陰離子交換柱上（例如參見圖1A)。值得注意的是，該柱俘獲非復合形式的肉毒桿菌 毒素，以使毒素蛋白與解離的非毒素蛋白可洗脫到不同的級分。所用的柱可以是本領域已 知的適合分離帶電蛋白的任何陰離子柱，其非限制性實例包括商購自GE Healthcare Life Sciences 的 Q 瓊脂糖 HP (Q Sepharose HP)、Q 瓊脂糖快流（Q Sepharose Fast Flow)或 Q XL瓊脂糖（Q XL S印harose)。在一些特別優選的實施方案中，使用Q XL瓊脂糖柱。在一 些實施方案中，該方法還包括在裝載到柱上以前，處理用于陰離子交換色譜的包含非復合