用于純化非復合的肉毒桿菌神經毒素的方法和系統的制作方法
【專利說明】用于純化非復合的肉毒桿菌神經毒素的方法和系統
[0001] 本申請是申請日為2010年10月20日、申請號為201080045567. 0、發明名稱為"用 于純化非復合的肉毒桿菌神經毒素的方法和系統"的發明專利申請的分案申請。
[0002] 本申請要求2009年10月21日提交的美國臨時申請No. 61/253, 810的優先權的 權益。該美國臨時申請的內容通過引用在此整體并入。 發明領域
[0003] 本發明大體上涉及用于從細胞培養物中純化游離的肉毒桿菌神經毒素以產生高 純度，高效價產品的色譜方法和系統。
[0004] 發明背景
[0005] 肉毒桿菌毒素是由細菌肉毒梭菌（Clostridium botulinum)以及其他梭菌屬物 種，諸如丁酸梭菌（Clostridium butyricum)和巴氏梭菌（Clostridium baraffi)產生的 神經毒性蛋白。該毒素阻斷神經肌肉傳遞，并在人和動物中引起神經性麻痹疾病，稱為肉毒 中毒。肉毒梭菌及其孢子通常存在于土壤和腐敗的動物尸體中，并且可以在不適當滅菌或 不適當密封的食物容器中生長，這是許多肉毒中毒病例的病因。肉毒中毒癥狀可以包括步 行困難、吞咽困難和講話困難，并可發展成呼吸肌麻痹，和最終死亡。
[0006] A型肉毒桿菌毒素是人類已知的最致命的天然物質。除了血清型A之外，還表征了 六種其他常見的免疫上不同的肉毒桿菌毒素，即肉毒桿菌毒素血清型B、Ci、D、E、F和G。不 同的血清型可通過用類型特異性抗體中和來區分，并且在它們引起的麻痹的嚴重度和它們 最經常感染的動物物種方面不同。已知的肉毒桿菌毒素血清型的每一種的肉毒桿菌毒素蛋 白分子的分子量是約150kD，包括連接到約50kD輕鏈的約IOOkD重鏈。然而，肉毒桿菌毒素 由梭菌細菌以150kD毒素與一個或多個非毒素蛋白的復合物釋放。例如，A型肉毒桿菌毒 素以900kD、500kD和300kD復合物（近似分子量）的形式存在。
[0007] 盡管已知毒性效應，但A型肉毒桿菌毒素在臨床上用于治療多種適應癥，包括例 如以骨骼肌活動過度為特征的神經肌肉障礙。例如，Β0Τ0Χ?是可商購自Irvine，Calif 的Allergan，Inc.的A型肉毒桿菌毒素復合物的商標。A型肉毒桿菌毒素用于例如治療自 發性瞼痙攣、斜視、頸部肌張力障礙（cervical dystonia)和眉間紋（面部）皺紋。其他血 清型也已在臨床上使用。例如，已表明B型肉毒桿菌毒素可用于治療頸部肌張力障礙。肉 毒桿菌毒素被認為以高親和力結合于運動神經元的突觸前膜，移位到神經元，并隨后阻斷 乙酰膽堿的突觸前釋放。
[0008] 用于臨床使用的肉毒桿菌毒素通常從細胞培養物分離，并已使用多種純化 方法。歷史上，通過一系列沉淀和切向流過濾步驟，以復合形式純化毒素。參見例如 Schantz E. J.等人，Properties and use of botulinum toxin and other microbial neurotoxins in medicine(肉毒桿菌毒素和其他微生物神經毒素在醫學中的性質和用 途），Microbiol Rev 1992年3月56(1):80-99。然而，這種方法提供了相對低的收率， 通常小于約10%。其他方法使用尺寸排阻色譜法、離子交換色譜法和/或親和力色譜 法° 參見例如 Schmidt J. J.等人，Purification of type E botulinum neurotoxin by high-performance ion exchange chromatography (通過高效離子交換色譜法純化 E 型肉毒桿菌神經毒素），Anal. Biochem. 1986 年 7 月；156 (1):213-219 ;Simpson L.L.等 人，Isolation and characterization of the botulinum neurotoxins (肉毒桿菌 神經毒素的分離和表征），Harsman S編輯.Methods in Enzymology (酶學方法）.第 165 卷，Microbial Toxins:Tools in Enzymology(微生物毒素：酶學中的工具）San Diego，Calif:Academic Press;第 165 卷；第 76-85 頁（1988) ;Kannan Κ·等人，Methods development for the biochemical assessment of Neurobloc(botulinum toxin type B)(肉毒毒素制劑（B型肉毒桿菌毒素）的生物化學評價的方法開發），Mov Disord 2000; 15(增刊 2) :20 (2000) ;Wang Y.C·，The preparation and quality of botulinum toxin type A for injection(BTXA)and its clinical use (注射用 A型肉毒桿菌毒素（BTXA)的 制備和質量，及其臨床用途），Dermatol Las Faci Cosm Surg2002;58(2002);和美國專利 申請公開 No. 2003/0008367。
[0009] 其他方法僅關注于毒素的重鏈或輕鏈之一，而不是完整的且有生物活性的肉毒桿 菌毒素蛋白。例如，通過重組方法單獨合成鏈中的一條。參見例如Zhou L等人，Expression and purification of the light chain of botulinum neurotoxin A:A single mutation abolishes its cleavage of SNAP_25and neurotoxicity after reconstitution with the heavy chain (A型肉毒桿菌毒素的輕鏈的表達和純化：單突變取消其SNAP-25裂解， 及與重鏈重構后的神經毒性），Biochemistry 1995 ;34 (46) :15175-81 (1995) JPJohnson S. K.等人 Scale-up of the fermentation and purification of the recombination heavy chain fragment C of botulinum neurotoxin serotype F, expressed in Pichia pastoris (畢赤酵母中表達的肉毒桿菌神經毒素血清型F的重組重鏈片段C的發酵和純化 的放大），Protein Expr and Purif 2003;32:1-9 (2003)。然而，這些方法需要額外步驟來 重新形成完整的且具有生物活性的肉毒桿菌毒素蛋白。
[0010] 最新的一種方法包括使用疏水相互作用色譜、混合模式和/或離子交換色譜純化 復合物形式的肉毒桿菌毒素。參見例如美國專利No. 7, 452, 697和7, 354, 740,其通過引用 在此并入。
[0011] 因此，本領域存在對用于分離穩定的、具有生物活性但非復合形式的完整的肉毒 桿菌毒素蛋白的改進的純化方法的需要。因此，本發明的目的是提供解決這些和其他需要 的組合物和方法。
[0012] 提出以上討論僅是為了提供對本領域所面對的問題的性質的更好理解，并且以上 討論不應以任何方式解釋為對現有技術的承認，并且也不應將本文中的任何參考文獻的引 述理解為承認，這些參考文獻構成本申請的"現有技術"。
[0013] 發明概述
[0014] 本發明涉及用于純化非復合的肉毒桿菌毒素的系統和方法。在一個實施方案中， 該方法包括純化粗制的非復合的肉毒桿菌毒素以得到純化的非復合的肉毒桿菌毒素。在該 實施方案中，該方法包括，將粗制的非復合的肉毒桿菌毒素裝載到陰離子交換柱，以將非復 合的肉毒桿菌毒素俘獲在陰離子交換柱上；用緩沖液洗脫非復合的肉毒桿菌毒素以得到包 含非復合的肉毒桿菌毒素的洗脫液；用來自陰離子交換柱的洗脫液裝載陽離子交換柱，以 允許俘獲非復合的肉毒桿菌毒素；和用另一緩沖液洗脫非復合的肉毒桿菌毒素以得到洗脫 液，由此獲得純化的非復合的肉毒桿菌毒素。
[0015] 在某些實施方案中，通過許多色譜步驟獲得肉毒桿菌毒素復合物本身。在一些實 施方案中，用于獲得肉毒桿菌毒素復合物的方法包括，獲得包含肉毒桿菌毒素復合物的樣 品；用該樣品裝載疏水相互作用柱以允許俘獲毒素，其中俘獲的肉毒桿菌毒素包含復合的 肉毒桿菌毒素；和洗脫復合的肉毒桿菌毒素。然后，從該復合物解離非復合的肉毒桿菌毒 素，并且非復合的肉毒桿菌毒素根據上述方法純化。在一些實施方案中，樣品通過以下獲 得：使包含肉毒桿菌毒素的發酵培養物經受酸以獲得酸沉淀物，其可經受額外的色譜前純 化步驟，所述色譜前純化步驟的非限制性實例包括切向流過濾（以濃縮沉淀物的不溶物 質）、核酸酶消化、凈化離心和/或過濾。
[0016] 在一些實施方案中，樣品在裝載到疏水相互作用柱前，經歷核酸酶消化。優選地， 核酸酶源自不含動物產物的過程，且更加優選地，整個純化過程不含動物產物或至少基本 上不含動物產物。
[0017] 在一些實施方案中，色譜分離中使用的樣品優選是上清液或濾液級分。
[0018] 純化的非復合的肉毒桿菌毒素包括A、B、Cn D、F、F和G型肉毒桿菌毒素中的至少 一種，且優選具有約150kD的分子量的A型肉毒桿菌毒素。在一些優選的實施方案中，純化 的非復合的肉毒桿菌毒素具有至少98%的純度；和/或具有至少200LD5(I單位/ng的活性。 在一些實施方案中，該方法產生至少約2mg/L發酵培養物的產量。在其他實施方案中，該方 法產生約1至約2mg/L發酵培養物的產量。
[0019] 通過參考以下本發明的詳細描述，本發明的這些方面和其他方面將被更好地理 解。
[0020] 附圖簡述
[0021] 圖1是對比用于直接純化非復合的肉毒桿菌毒素的根據本發明的方法的一個實 施方案（圖1A)與用于純化復合的肉毒桿菌毒素的方法（圖1B)的概括流程圖。
[0022] 詳細描述
[0023] 本發明涉及用于純化非復合的肉毒桿菌毒素的系統和方法。在某些實施方案中， 該方法包括通過下列來純化粗制的非復合的肉毒桿菌毒素：用粗制的非復合的肉毒桿菌毒 素裝載陰離子交換柱以允許陰離子交換柱俘獲非復合的肉毒桿菌毒素。然后，非復合的肉 毒桿菌毒素用緩沖液洗脫，以得到包含非復合的肉毒桿菌毒素的洗脫液。將來自陰離子柱 的洗脫液裝載到陽離子交換柱，以允許俘獲非復合的肉毒桿菌毒素，然后用緩沖液洗脫純 化的非復合的肉毒桿菌毒素，從而獲得純化的非復合的肉毒桿菌毒素。
[0024] 在一些實施方案中，本發明提供了以相對少的步驟純化非復合的肉毒桿菌毒素， 以產生高產量、高純度和高效價的產物。本發明的范圍內的方法和系統可用于由發酵培養 物有效產生穩定但非復合的肉毒桿菌毒素。在其他實施方案中，該方法還包括，提供包含肉 毒桿菌毒素復合物的樣品，并用該樣品裝載疏水相互作用柱，從而允許通過疏水相互作用 柱俘獲肉毒桿菌毒素復合物。然后，用緩沖液從柱洗脫肉毒桿菌毒素復合物。從肉毒桿菌 毒素復合物解離粗制的非復合的肉毒桿菌毒素，以獲得包含粗制的非復合的肉毒桿菌毒素 的混合物。在這一實施方案中，包含粗制的非復合的肉毒桿菌毒素的混合物根據以上描述 的方法進行純化，以得到純的或基本純的肉毒桿菌毒素。
[0025] 本發明的一個方面是認識到，包含非復合的肉毒桿菌毒素作為活性成分的藥物組 合物提供了比包含復合形式的藥物組合物更高的純度。通常與肉毒桿菌毒素復合物相關的 非毒素蛋白可占復合物重量的約90%。因此，提供復合物形式的肉毒桿菌毒素必然包括按 重量計至少約90%的雜質。換言之，按重量計藥物組合物的至少約80 %至約90 %將包括細 胞衍生的雜質，它們不是活性分子的一部分，也不是其生物活性所必須的。然而，這些雜質 代表這樣的細胞衍生的物質，當其被施用于患者時，可增加對藥物的不期望的免疫反應的 風險；可增加不期望的副作用的風險；和/或可增加致病劑的傳播的風險。相反，可通過本 文描述的方法和系統獲得的非復合的產物的高純度減少了可能殘留在藥物組合物中的宿 主細胞雜質的量，由此減少了伴隨