的肉毒桿菌毒素的混合物。例如，如本領域所知的，基于本文提供的教導，可確定緩沖液和 PH條件，以使所使用的特定柱的收率最大化。對于裝載和在柱中的使用，例如，合適的緩沖 液包括但不限于陽離子緩沖液，優選地不與陰離子交換柱相互作用或基本上不與陰離子交 換柱相互作用的陽離子緩沖液。合適的陽離子緩沖液包括例如TriS、biS-TriS、三乙醇胺、 N-甲基二乙醇胺。為裝載和平衡柱，可使用約7. 2至約8. 6的pH ;更優選地約7. 4至約8. 2 的pH ;且最優選地約7. 8的pH。
[0062] 如本領域所知的，為了從陰離子交換柱洗脫俘獲的（結合的）毒素和其他解離組 分，可使用合適的緩沖液。合適的緩沖液的實例包括例如，氯化鈉（NaCl);和氯化鉀（KCl)。 在一些特別優選的實施方案中，使用上升梯度的氯化鈉。例如，可使用具有約〇. OM至約 0. 4M NaCl，更優選地約0.0 M至約0. 5M NaCl，且更加優選地約0.0 M至約0. 6M NaCl的濃度 范圍的氯化鈉緩沖液。在不同級分中分離的雜質可包括例如解離的復合物的一種或多種非 毒素蛋白，諸如非毒素血凝素和/或非毒素非血凝素蛋白。如本領域所知的，可鑒別包含產 物峰的級分。在約7. 4至約8. 4之間，優選約7. 8的pH下，峰可出現在例如約8mSem至約 22mSem (對應于約0. 08M至約0. 18M NaCl)下。相反，其他雜質可在約30至約45mSem (對 應于約0· 25M至約0· 35M NaCl)下洗脫。
[0063] 可鑒別包含洗脫的非復合的肉毒桿菌毒素的級分，以提供包含非復合的肉毒桿菌 毒素的洗脫液。可通過本領域所知的方法鑒別峰，例如使用HPLC、蛋白印跡分析、ELISA、非 還原型SDS-PAGE等等。例如，在非還原條件下的SDS-PAGE可鑒別出約150kDa的毒素帶， 而其他雜質將出現在對應于更小分子的帶。然后，包含非復合形式的洗脫液可經受進一步 的色譜純化步驟。
[0064] 在一個特別優選的實施方案中，通過SDS-PAGE評價毒素純度。如本領域技術人員 所了解的，SDS-PAGE分析可以在切割存在于蛋白中的二硫鍵的試劑的缺失或存在（即分別 地，非還原條件或還原條件）下進行。例如對于A型肉毒桿菌毒素，A型肉毒桿菌毒素蛋白分 子的成熟和活性形式包括分別為IOOkD和50kD的兩條肽鏈，其通過非共價相互作用以及二 硫鍵保持在一起。當使用非還原條件測定通過本發明的過程產生的A型肉毒桿菌毒素時，A 型肉毒桿菌毒素蛋白分子迀移為約150kD的單一蛋白帶，且測量的純度通常大于98%。當 每條凝膠泳道裝載的A型肉毒桿菌毒素蛋白的量保持在光密度計的動態范圍內時，存在很 少（如果有的化）的可檢測的雜質帶，得到100%的測量純度。當A型肉毒桿菌毒素過載，以 致主要的毒素帶高于光密度計的動態范圍時，可檢測到一些較少的雜質帶（多達1-2% )。
[0065] 然而，當A型肉毒桿菌毒素的SDS-PAGE分析在還原條件下進行時，肉毒桿菌毒素 的二硫鍵被切斷，且A型肉毒桿菌毒素蛋白迀移為分別具有IOOkD和50kD的分子量的兩個 組分。當裝載A型肉毒桿菌毒素蛋白以致主要物質高于光密度計的動態范圍，且SDS-page 在還原條件下運行時，可更容易地檢測到較少的雜質物質。例如，在這些條件下，由于在發 酵和回收過程中不完全的蛋白酶解加工，可存在多達5%的150kD物質。在這些條件下，本 發明的方法產生通常大于總蛋白的90%，且更可能大于總蛋白的95%的毒素產物（包括有 活性的切割的IOOkD和50kD的多肽鏈）。因此，如本文描述的，報道的毒素的測量純度依賴 于所用的SDS-PAGE方法的細節。此外，雖然以上實例涉及A型肉毒桿菌毒素，但本領域技 術人員將理解，可容易地修改本文描述的SDS-PAGE分析，以評價肉毒桿菌毒素的其他血清 型的純度。
[0066] 在某些實施方案中，將來自陰離子柱的包含非復合的肉毒桿菌毒素的洗脫液裝載 到陽離子交換柱（參見例如圖1A)。值得注意地，該柱也俘獲非復合形式的肉毒桿菌毒素， 以致毒素蛋白和解離的非毒素蛋白可洗脫在不同的級分中。所用的柱可以是本領域已知 的適合于分離蛋白的任何陽離子柱，其非限制性實例包括SP瓊脂糖（SP Sepharose)柱， 包括 SP 瓊脂糖 HP (SP Sepharose HP)柱或 SP 瓊脂糖快流（SP Sephrose Fast Flow)柱； Mono S柱；或Source-S柱，諸如Source_30S柱或優選地Source_15S柱，它們都商購自GE Healthcare Life Sciences。在一些實施方案中，該方法還包括在裝載到柱上之前，處理用 于陽離子交換色譜的來自陰離子交換柱的包含非復合的肉毒桿菌毒素的洗脫液。在一些優 選的實施方案中，調整pH，以致裝載到柱上的洗脫液的pH允許游離毒素與柱有效地結合。 例如，pH可以維持在約4至約8的范圍內，優選地約5至約7. 5,更優選地約6至約7,且最 優選地約7。此外，在一些實施方案中，可在裝載到陽離子交換柱上之前，處理來自陰離子 柱的洗脫液以減少電導率，例如使用磷酸鈉緩沖液，其非限制性實例是約20mM NaH2P〇d9 磷酸鈉緩沖液。例如，來自陰離子柱的洗脫液可含有多達約〇. 15M的NaCl，從而在約20mM NaH2POjl沖液中的稀釋減少了電導率。在一些特定的實施方案中，電導率從約12mSem減 少至約3. 3mSem。在緩沖液稀釋、透析或本領域已知的其他方法也可用于減少電導率。
[0067] 為了裝載和在柱中使用，例如，合適的緩沖液包括但不限于陰離子緩沖液，優選地 不與陽離子交換柱相互作用或基本上不與陽離子交換柱相互作用的陰離子緩沖液。合適的 陰離子緩沖液包括例如MES、HEPES等等，且優選地磷酸鈉緩沖液。為了裝載和平衡柱，可使 用約4至約8之間的pH ;優選地約5至約7. 5之間的pH ;更優選地約6至約7之間的pH ; 且最優選地約6. 8至約7的pH。
[0068] 如本領域所知的，為了從陽離子交換柱洗脫俘獲的（結合的）毒素（與其他解離 的非毒素蛋白和其他雜質分離），可使用合適的緩沖液。在一些特別優選的實施方案中，使 用上升梯度的氯化鈉。氯化鈉梯度的合適的濃度范圍可以從約〇. OM至約IM NaCl。可使用 的其他鹽包括例如氯化鉀，其可以約0.0 M至約0.5M KCl的濃度梯度使用。如本領域所知 的，可鑒別包含產物峰的級分。在約6. 7的pH下，峰可以出現在例如約18至約25mSem(對 應于約0.3M至約0.4M NaCl)下。即，可鑒別包含洗脫的非復合的肉毒桿菌毒素的級分以 提供來自陽離子柱的包含非復合的肉毒桿菌毒素的洗脫液。在特別優選的實施方案中，來 自陽離子柱的洗脫液表示高純度的、高產量的并具有高活性的非復合的肉毒桿菌毒素。相 反，圖IB中描述的過程在最終的洗脫液中提供了 900kD的A型肉毒桿菌毒素復合物。
[0069] 純化的非復合的肉毒桿菌毒素產物
[0070] 本文描述的方法和系統可用于提供高純度的、高產量的并具有高活性的非復合的 肉毒桿菌毒素。參見以下實施例1。該產物還易于穩定，并可常規地用于制備安全的藥物組 合物。
[0071] 在一些優選的實施方案中，純化的非復合的肉毒桿菌毒素是至少約80%純的，優 選地至少約90%純的，更優選地至少約95%純的，更加優選地至少約98%純的，且最優選 地至少約99%純的或甚至是約100%純的。"純化的非復合的肉毒桿菌毒素"指與其他蛋白 和雜質分離或基本上分離的游離的肉毒桿菌毒素蛋白分子，所述其他蛋白和雜質在其從培 養物或發酵過程獲得時，可以伴隨非復合的肉毒桿菌毒素。例如"80%純的"純化的非復合 的肉毒桿菌毒素指分離的或基本上分離的非復合的肉毒桿菌毒素蛋白，其中如通過其他合 適的分析方法所測定的，毒素蛋白占存在的總蛋白的80%，所述分析方法的非限制性實例 包括SDS-PAGE、CE和HPLC。例如，在一些優選的實施方案中，包含非復合的肉毒桿菌毒素 的陽離子柱洗脫液是至少約99 %純的，且含有小于約1 %的宿主細胞蛋白，所述宿主細胞 蛋白不是原本存在的約150kD的肉毒桿菌毒素。
[0072] 在一些優選的實施方案中，純化的非復合的肉毒桿菌毒素具有至少約150LD5Q單 位/ng，優選地至少約180LD5(I單位/ng，更優選地至少約200LD 5(|單位/ng，更加優選地至少 約210LD5(I單位/ng，且最優選地至少約220LD 5(|單位/ng的活性。肉毒桿菌毒素的一個單位 被定義為，當腹膜內注射到雌性Swiss Webster小鼠（每只重量為約18-20克）時的LD5Q。 換言之，肉毒桿菌毒素的一個單位是殺死一組雌性Swiss Webster小鼠的50%的肉毒桿菌 毒素的量。"活性"在本文中與相關表述"生物活性"、"效價"和"毒性"可互換使用，用于描 述肉毒桿菌毒素的作用。
[0073] 在優選的實施方案中，可通過本文描述的方法和系統獲得的非復合的肉毒桿菌毒 素顯示出生物活性。即，在優選的實施方案中，當根據本發明的優選實施方案純化時，產物 的生物活性或毒性不損失，即使在純化期間，除去了與毒素蛋白天然締合的非毒素蛋白。在 更加優選的實施方案中，使用本發明的范圍內的給定的一組過程和參數獲得的效價是一致 的和/或可重現的。例如，進行的效價測量可具有低于約40 %的變異性，優選地低于約35 % 的變異性，更優選地低于約30 %的變異性，更加優選地低于約25 %的變異性，且最優選地 低于約20%的變異性。
[0074] 在一些優選的實施方案中，純化過程提供了高產量的非復合的肉毒桿菌毒素。例 如從30L發酵培養物獲得的產量可以是至少約30mg，優選地至少約40mg，更優選地至少約 70mg，更加優選地至少約80mg，且最優選地至少約90mg，分別對應于至少約lmg/L，優選地 至少約I. 3mg/L，更優選地至少約2. 3mg/L，更加優選地至少約2. 7mg/L，且最優選地至少約 3mg/L的產量。在更加優選的實施方案中，使用本發明范圍內的給定的一組過程和參數獲得 的產量是可重現的。例如，測量的產量可具有低于約40%的變異性，優選地低于約35%的 變異性，更優選地低于約30 %的變異性，更加優選地低于約25 %的變異性，且最優選地低 于約20%的變異性。
[0075] 在一些特別優選的實施方案中，在使用本文描述的方法和系統的純化期間，純化 的非復合的肉毒桿菌毒素是穩定的。已認為，從肉毒桿菌毒素復合物，諸如A型肉毒桿菌毒 素復合物除去締合的非毒素蛋白產生顯著不穩定的肉毒桿菌毒素產物。然而，如上文所討 論的，本發明提供了可穩定分離游離的肉毒桿菌毒素（其不具有通常被認為是在純化過程 期間維持穩定性所需的締合的非毒素蛋白）的方法和系統。
[0076] 在一些優選的實施方案中，本文描述的方法和系統提供了需要非常少的色譜后步 驟（例如在維持儲存期間的穩定性方面和在藥物應用的適用性方面）的非復合的肉毒桿菌 毒素。例如，如本領域所知的，可以將硫酸銨加入游離的肉毒桿菌毒素，以制備用于儲存的 硫酸銨懸浮液。包含游離的肉毒桿菌毒素和硫酸銨的組合物可易于儲存在冰箱中，且隨后 可容易地回復以用于藥物應用。事實上，可通過本文描述的方法獲得的毒素的穩定性、高產 量和純度，和高且穩定的效價促進了純化的產物的藥物應用，如在下文更加詳細地描述的。
[0077] 純化的非復合的肉毒桿菌毒素的用途
[0078] 根據本發明純化的非復合的肉毒桿菌毒素可用于制備包含毒素作為活性成分的 藥物組合物，所述藥物組合物用于施用給將從這種藥物組合物獲得益處的任何受試者。在 優選的實施方案中，待治療的受試者是哺乳動物，優選人類。本文使用的"藥物組合物"指 其中活性成分可以是肉毒桿菌毒素的制劑。制劑將含有至少一種額外的成分，并且適合于 向受試者（諸如人類患者）診斷性、治療性和/或美容性施用。藥物組合物可以是液體或 固體；且可以是單組分或多組分系統，例如用稀釋劑（諸如鹽水）重構的凍干組合物。
[0079] 本發明的另一方面提供了純化的肉毒桿菌毒素分子至患者的施用。本文使用的 "施用"指向受試者或患者提供藥物組合物。藥物組合物可通過本領域已知的任何方法施 用，包括例如肌內（i.m.)、皮內、鼻內或皮下施用，鞘內施用，顱內、腹膜內（i.p.)施用或施 用的局部（透皮）和植入（例如緩釋裝置的植入）途徑。在某些優選的實施方案中，