的不期望的反應和/或傳播的風險。因此，本文描述的方 法和系統可提供更適合于制備更安全、更純的藥物組合物的形式的肉毒桿菌毒素。
[0026] 此外，不同于復合形式，根據本文描述的方法制備的游離的肉毒桿菌毒素不需要 在血液源產品中被穩定以便儲存。例如，A型肉毒桿菌毒素復合物通常被穩定在包含白蛋白 的賦形劑中，所述白蛋白源自人類血液。例如，Β0Τ0Χ?包括以真空干燥形式包裝的純化 的A型肉毒桿菌毒素復合物、人類血清白蛋白和氯化鈉。Dysport和Xeomin也是這樣。雖 然篩選降低了致病劑污染的可能性，但是人類血液在藥物制劑中的使用通常增加了某些致 病劑（例如不能或還沒有被篩選出來的致病劑）的不期望的傳播的風險。相反，如本文所 教導的，根據本發明制備的游離的肉毒桿菌毒素可穩定地儲存在硫酸銨中。此外，如本文所 討論的，在一些優選的實施方案中，本發明的方法和系統基本上、大體上或完全不含動物產 物。穩定儲存基本上、大體上或完全不含動物產物的毒素產物的能力還降低與動物源產物 相關的潛在風險。因此，本文描述的方法和系統提供了在安全性方面特別適合于藥物應用 的形式的肉毒桿菌毒素，例如，可制備和儲存基本上、大體上或完全不含動物產物的藥物組 合物。
[0027] 在某些優選的實施方案中，本文描述的方法和系統是可規模化的和/或依從cGMP 的。因此，本文描述的方法和系統可以以商業化的工業規模使用，以產生用于例如藥物組合 物中的非復合的肉毒桿菌毒素。依從cGMP的方法或系統是指，可遵循由美國聯邦管理法規 要求的當前藥品生產和質量管理的管理機構要求的方法或系統。在一些優選的實施方案 中，非復合的肉毒桿菌毒素產物因為其易于儲存和使用、高活性、高純度、穩定性和/或提 高的安全性，特別適合于大規模的生產。
[0028] 本文使用的"肉毒桿菌毒素"指可由梭菌細菌生產的神經毒素蛋白分子，以及其重 組產生的形式。重組肉毒桿菌毒素可具有例如由重組梭菌屬和/或非梭菌屬物種經重組技 術合成的毒素蛋白的輕鏈和/或重鏈。"肉毒桿菌毒素"在本文中與相關表述"肉毒桿菌神 經毒素"、"神經毒素"或簡單的"毒素"可互換使用。"肉毒桿菌毒素"包括肉毒桿菌毒素血 清型A、B、Q、D、E、F和G中的任何一種，并且還包括復合形式和非復合形式。
[0029] "復合形式"指包含肉毒桿菌毒素蛋白（即具有約150kD的分子量的毒素分子）以 及至少一個締合的天然非毒素蛋白的肉毒桿菌毒素復合物。構成復合物的非毒素蛋白通常 包括非毒素血凝素蛋白和非毒素非血凝素蛋白。因此，復合形式可包括肉毒桿菌毒素分子 (神經毒性組分）和一個或多個非毒素血凝素蛋白和/或一個或多個非毒素非血凝素蛋白。 在某些實施方案中，復合物的分子量大于約150kD。例如，A型肉毒桿菌毒素的復合形式可 具有約900kD、約500kD或約300kD的分子量。B型和C1型肉毒桿菌毒素的復合形式可具有 500kD的分子量。D型肉毒桿菌毒素的復合形式可具有約300kD或約500kD的分子量。最 后，E型和F型肉毒桿菌毒素的復合形式可具有約300kD的分子量。
[0030] "非復合的"肉毒桿菌毒素指具有約150kD的分子量的分離的，或大體上或基本上 分離的肉毒桿菌毒素蛋白。即，"非復合的"形式不包括通常與復合形式相關的非毒素蛋白， 諸如非毒素血凝素和非毒素非血凝素蛋白。"非復合的"肉毒桿菌毒素在本文中與"游離的" 肉毒桿菌毒素可互換使用。由天然肉毒梭菌細菌制備的所有肉毒桿菌毒素血清型由細菌合 成為無活性的單鏈蛋白，然后其被蛋白酶切割或切斷，變得具有神經活性。該蛋白包括通過 二硫鍵連接到約50kD輕鏈的約IOOkD重鏈。
[0031] 肉毒桿菌毒素復合物可通過多種方法解離成毒素和非毒素蛋白，包括例如升高pH 至約7. 0,在約7. 3的pH下用紅細胞處理復合物，和/或使復合物經歷分離過程，諸如在約 7至約8的pH下在合適的緩沖液中的柱色譜。
[0032] 本發明包括能夠純化非復合的肉毒桿菌毒素（其不具有通常被認為是在純化過 程中維持穩定性所必須的締合的非毒素蛋白）的系統和方法。在優選的實施方案中，本文 描述的方法和系統有利于純化游離的肉毒桿菌毒素，而沒有穩定性損失。"穩定性"或"穩 定的"指保留通過二硫鍵彼此連接的約IOOkD重鏈和約50kD輕鏈，并處于提供生物活性的 構型的肉毒桿菌毒素蛋白分子。
[0033] 在一些實施方案中，本發明的范圍中的特定系統連同本發明的范圍中的特定方法 一起操作。本發明的范圍中的系統可包括用于相應的多個（優選連續系列（consecut ive series))色譜步驟的多個（優選連續系列）色譜柱。此外，本發明的范圍中的系統可包括 用于相應的多個（優選連續系列）非色譜步驟（例如色譜前步驟）的多個（優選連續系 列）非色譜設備，諸如過濾和/或離心裝置。
[0034] 在優選的實施方案中，本發明的范圍中的方法包括，從發酵培養物獲得包含肉毒 桿菌毒素的樣品；使其經受多個色譜前純化；然后，使其通過多個色譜柱，以得到高度純化 的高效價的非復合的肉毒桿菌毒素。這樣的純化的游離的肉毒桿菌毒素可用于制備包含游 離的肉毒桿菌毒素作為活性成分的藥物組合物。
[0035] 本發明的一些優選實施方案的色譜前過程和色譜過程的所有步驟在圖IA中示 出。為了比較，圖IB示出了用于獲得純化的肉毒桿菌毒素復合物的常規方法。簡而言之， 圖IB描述了包括以下的過程：發酵培養物的深度過濾，隨后切向流過濾所得的濾液（使用 300kD超微過濾）；隨后是凈化離心步驟。然后，將離心步驟獲得的團塊（不溶性級分）再 懸浮于氯化鈉中，并裝載到疏水相互作用柱或離子交換柱。重復色譜純化步驟至少三次，以 得到含有900kD A型肉毒桿菌毒素復合物的最終洗脫液。
[0036] 發酵和酸沉淀
[0037] 如圖IA所示，非復合的肉毒桿菌毒素通常由發酵培養物純化。本文使用的"發酵 培養物"指包含正在合成和/或已經合成至少一種肉毒桿菌毒素的細胞的培養物或培養基， 和/或其組分。例如，梭菌屬細菌，諸如肉毒梭菌可以在有益于細菌生長的環境（溫暖的厭 氧氣氛）中，在瓊脂平板上培養。培養步驟通常允許獲得具有期望的形態和其他特征的梭 菌菌落。然后，所選的培養的梭菌菌落可以在合適的培養基中發酵成發酵培養物。所培養 的細胞可以包括非梭菌屬物種作為宿主細胞（諸如大腸桿菌（E. coli)或酵母細胞），通過 重組技術使得它們能夠生物合成肉毒桿菌毒素。合適的發酵培養條件可依賴于所用的宿主 細胞，并且通常是本領域已知的。
[0038] 在優選的實施方案中，可以允許發酵進展至完成，以致細胞成熟，并已生物合成了 肉毒桿菌毒素。肉毒梭菌培養物的生長通常在約24小時至約36小時之后完成。在一段額 外的時間段后，細菌通常溶解，并將合成的肉毒桿菌毒素復合物以復合形式釋放到培養基 中。例如，在約60小時至約96小時的發酵期間，大多數肉毒梭菌細胞經受溶解，并釋放A 型肉毒桿菌毒素復合物。
[0039] 在一些實施方案中，發酵培養物可包括在常規發酵培養程序中使用的一種或多種 動物產物，諸如動物蛋白。例如，肉毒桿菌毒素可使用公知的Schantz方法的改良版本，通 過肉毒梭菌的厭氧發酵來生產（參見例如Schantz E.J.等人，Properties and use of botulinum toxin and other microbial neurotoxins in medicine (肉毒桿菌毒素和其 他微生物神經毒素在藥物中的性質和用途），Microbiol Rev 1992年3月；56(1):80-99; Schantz E. J.等人Preparation and characterization of botulinum toxin type A for human treatment (用于人類治療的A型肉毒桿菌毒素的制備和表征），第3章 Jankovic J 編輯· Neurological Disease and Therapy. Therapy with botulinum toxin (神經學 疾病和治療·用肉毒桿菌毒素治療）（1994) ,New York, Marcel Dekker ;1994,第41-49 頁和；Schantz E. J.等人，Use of crystalline type A botulinum toxin in medical research (結晶A型肉毒桿菌毒素在醫學研宄中的用途），Lewis G E Jr編輯Biomedical Aspects of Botulism(肉毒中毒的生物醫學方面）（1981)New York, Academic Press,第 143-50頁，每個文獻通過引用并入本文）。用于獲得肉毒桿菌毒素的Schantz方法和改良 的Schantz方法使用動物產物，包括在培養瓶（culture vial)中的動物源Bacto-Cooked 肉培養基，和在發酵培養基中的酪蛋白。此外，Schantz毒素純化使用來自牛來源的DNA酶 和RNA酶水解存在于發酵培養物中的核酸。
[0040] 然而，含有使用包含動物源產物的過程純化的活性成分的藥物的施用可能使患者 經受接受不同的致病劑的潛在風險。例如，朊病毒可存在于包含污染的動物源產物的藥物 組合物中，諸如引起克-雅二氏病的朊病毒。作為另一個實例，當動物產物用于制備藥物組 合物的過程中時，存在傳播海綿狀腦病（TSE)，諸如牛海綿狀腦病（BSE)的風險。然而，經 不含動物產物的過程獲得的肉毒桿菌毒素的使用減少了此類風險。因此，在一些優選的實 施方案中，本發明提供了不含動物產物，或大體上或基本上不含動物產物的（APF)方法/過 程。"不含動物產物的"、"大體上不含動物產物的"或"基本上不含動物產物的"分別包括 "不含動物蛋白的"、"大體上不含動物蛋白的"或"基本上不含動物蛋白的"，并且分別指不 存在、大體上不存在或基本上不存在源自動物的產物，源自動物的產物的非限制性實例包 括源自血液或匯集的血液（pooled blood)的產物。本文使用的"動物"指哺乳動物（諸如 人類）、禽類、爬行動物、兩棲動物、魚類、昆蟲、蜘蛛或其他動物物種，但排除微生物，諸如細 菌和酵母。
[0041] 不含動物產物的方法/過程（或大體上或基本上不含動物產物的方法/過程） 指這樣的方法/過程，其完全、基本上或大體上不含動物源產物、試劑和蛋白諸如免疫球蛋 白、其他血液產品、副產物或消化物；肉產物、肉副產物、肉消化物；以及奶或乳制品、副產 物或消化物。因此，不含動物產物的發酵培養程序的實例是發酵過程，諸如細菌培養，其排 除血液、肉和乳制品、副產物或消化物。用于獲得非復合的肉毒桿菌毒素的不含動物產物的 發酵過程降低了當施用于人類時，可伴隨毒素的病毒、朊病毒或其他不期望的物質的污染 的可能性。
[0042] 使用梭菌屬培養物的不含動物產物的發酵程序描述于例如美國專利 No. 7, 452, 697和7, 354, 740,其通過引用在此并入。例如，用于產生肉毒桿菌毒素的生長培 養基可包括基于植物的產物（而不是動物源產物），諸如基于大豆的產物和/或Lupinus campestris的脫苦種子（debittered seed)。用于不含動物產物的發酵培養的基于大 豆的發酵培養基例如可包括基于大豆的產物、碳源諸如葡萄糖、鹽諸如NaCl和KC1、含磷 酸鹽的成分諸如Na2HPOjP KH2PO4、二價陽離子諸如鐵和鎂、鐵粉、氨基酸諸如L-半胱氨 酸和L-酪氨酸等等。優選地，大豆是水解的大豆，且水解使用非源自動物的酶進行。水 解的大豆的來源包括但不限于Hy-Soy (Quest International)、大豆蛋白胨（Gibco)、 Bac-soytone(Difco)、AMIS0Y (Quest)、NZ大豆（Quest)、NZ大豆BL4、NZ大豆BL7、SE50M(DMV International Nutritionals, Fraser, Ν· Y.)和 SE50MK(DMV)〇
[0043] 如圖IA所示，在某些實施方案中，包含肉毒桿菌毒素的樣品獲自發酵培養物。例 如，在發酵一段時間之后，在不含動物產物的或非不含動物產物的培養基中，肉毒桿菌毒 素復合物被釋放到培養基中，并可通過沉淀收獲。例如，在一些實施方案中，如在公知的 Schantz方法中，包含肉毒桿菌毒素的發酵培養基可經受酸沉淀，以促使肉毒桿菌毒素復合 物與細胞碎片締合，并形成酸沉淀