-X10-S108A、質 粒 pAAV-CB-F8-n〇-E115D、質粒 pAAV-CB-F8-n〇-H117Q、質粒 pAAV-CB-F8-n〇-L129F、質 粒 PAAV-CB-F8-X10-K132G、質粒 pAAV-CB-F8-X10-Q134H、質粒 pAAV-CB-F8-X10-T147M、質 粒PAAV-CB-F8-X10-P152L。這些突變按照如下實施例4(圖7)所述進行測試。
[0172] 使用一組具有對應于G132位置的NNN的簡并寡核苷酸來創建對應于G132的 全部19種突變。由此產生的因子VIII突變體質粒包括質粒pAAV-CB-F8-G132A、質粒 PAAV-CB-F8-G132I、.··.質粒pAAV-CB-F8-G132V等。最后一個字母表示在該特定位置上 的氨基酸取代。類似的策略可以用于產生根據本發明其它取代。
[0173] 上述質粒含有AAV-ITR并可用于產生AAV載體。肝特異性啟動子可用于替代CB 啟動子以減小表達盒的大小并提高載體在肝中的包裝和表達。也可以使用其他組織特異性 啟動子。
[0174] 將FVIII重鏈和FVIII終止密碼子之間的序列從FVIII表達載體中除去。所得重 鏈（HC)突變體包含FVIII的前745個氨基酸，缺乏B結構域（BDD)和輕鏈（LC)序列。質 粒 pAAV-CB-HC-ΧΙΟ 包含對應于重鏈中的 I86V、Y105F、A108S、D115E、Q117H、F129L、G132K、 H134Q、M147T和L152P的突變。質粒pAAV-CB-HC-X5包含對應于重鏈中的I86V、A108S、 G132K、M147T、L152P的突變。質粒pAAV-CB-HC-G132K包含對應于重鏈中的G132K的突變。 或者，可將酸性區3 (a3)加入到這些構建體中以獲得在HC1690背景下的HC突變體。
[0175] 實施例2 :不同閔子VIII突奪體在組織培養細朐中分泌的比較
[0176] 在BHK細胞（圖A)或293細胞（圖B)中分別轉染質粒pAAV-CB-hBDD-F8 (重量）、 質粒 pAAV-CB-hBDD-F8-X10、質粒 pAAV-CB-hBDD-F8-X5 和質粒 pAAV-CB-hBDD-F8-G312K。 收獲介質中分泌的F8,并在轉染后48小時通過aPTT測定法對其進行測定。將野生型人 BDD-F8 (hBDD)的表達/分泌設定為100%。如圖7所示，與野生型hF8相比，hF8突變體以 約2-8. 5倍更高的表達水平分泌。
[0177] 實施例3 :人閔子VIII突奪體體內分泌的比較
[0178] 質粒pAAV-CB-hBDDF8 (B 結構域缺失（BDD) wt hF8)、質粒pAAV-CB-hBDDF8-X10 (具 有 10 個取代的 hF8-BDD ;SEQ ID NO: 3)、質粒 pAAV-CB-hBDD-F8-X5 (具有 5 個取代的 hF8 ; SEQ ID N0:4)和質粒 pAAV-CB-hBDD-F8-G312K(具有 G132K 取代的 hF8)分別注射到 Blab/ c和F8雙敲除小鼠中。收集血液中分泌的F8并在注射后48小時通過aPTT測定法對其進 行測定。將野生型人F8(hBDD-F8)的表達/分泌設定為100%。這里描述的所有突變優于 野生型因子VIII。如圖8所示，與野生型hF8相比，hF8突變體以約1. 2-5. 2倍更高的表達 水平分泌。
[0179] 實施例4 :不同閔子VIII突奪體分泌的比較
[0180] 修飾編碼hBDD-F8_X10中的氨基酸的質粒以將突變取代恢復為其相應的如表中 所示的野生型氨基酸。例如，hBDD-F8-X10-V86I表示hBDD-F8-X10中的"V86"被改回為 "I"。在hBDD-F8-X10-6p中，hBDD-F8-X10中的10個突變氨基酸中的6個被恢復為其相應 的野生型氨基酸。在293細胞中分別轉染上述質粒。收獲介質中分泌的F8,并在轉染后48 小時通過aPTT測定法對其進行測定。將hBDD-F8-X10的表達/分泌設定為100%。如圖9 所示，與hBDD-F8-X 10突變體相比，所有回復體表現出減少的表達和分泌。
[0181] 實施例4 :不同閔子VIII突奪體分泌的比較
[0182] 將AAV8載體AAV-apoEhAAT-hF8HC1690(攜帶人因子VIII重鏈氨基酸 #1-745和a3序列，apoEhAAT:具有apo E增強子的人α -個抗胰蛋白酶啟動子）和 AAV-apoEhAAT-hF8-HC-X10 (具有10個取代的hF8HC)各自與輕鏈表達載體一起分別注射 到F8敲除小鼠中（劑量：各載體1E11顆粒/小鼠）。收集血液中分泌的F8,并在指定時間 通過aPTT測定法對其進行測定。將野生型人F8重鏈（hF8-HC1690)的表達/分泌設定為 100%。這里描述的hF8-HC1690-X10突變體優于野生型重鏈表達。如圖10所示，與野生型 hF8HC相比，hF8-HC1690-X10突變體以約6-20倍更高的表達水平分泌。
[0183] 實施例6 :在293細朐中G132 _子VIII重鏈突奪體的分泌的比較
[0184] 在293細胞中轉染質粒pAAV-CB-hF8-HC1690(攜帶人因子VIII的重鏈氨基酸 #1-745和a3序列；見圖1)或在G132具有指定取代的質粒與F8輕鏈（LC)表達質粒。收 集介質中分泌的F8,并在轉染后48小時通過aPTT測定法對其進行測定。將野生型人F8 重鏈（hF8-HC1690)的表達/分泌設定為100%。如圖11所示，與野生型hF8HC相比， F8G132HC1690突變體以約1. 4-3. 4倍更高的表達水平分泌。
[0185] 實施例7 :不同閔子VIII重鏈突奪體在體內表汰/分泌的比較
[0186] 將質粒pAAV-CB-hF8-HC1690(攜帶人因子VIII的重鏈氨基酸#1-745和酸性區 3(a3)序列；見圖 1，6)、質粒 pAAV-CB-hF8-HC1690-X10(具有 10 個取代的 hF8 重鏈；SEQ ID NO: 5)、質粒pAAV-CB-hF8-HC1690-X5 (具有5個取代的hF8重鏈連同a3序列一起；SEQ ID N0:6)以及質粒pAAV-CB-hF8-HC1690-G312K(具有G132K取代的hF8重鏈和a3序列）各自 連同輕鏈表達質粒一起注射到Blab/c和F8雙敲除小鼠中。收集血液中分泌的F8并在注 射后48小時通過aPTT測定法對其進行測定。將野生型人F8重鏈（hF8-HC1690)的表達/ 分泌設定為100%。如圖12所示，與野生型hF8HC相比，hF8突變體以約2. 5-4. 5倍更高的 表達水平分泌。
[0187] 實施例8 :L152 _子VIII重鏈突奪體在293細朐中分泌的比較
[0188] 在293細胞中分別轉染質粒pAAV-CB-hF8-HC1690(攜帶人因子VIII的重鏈氨基 酸#1-745和酸性區3 (a3)序列；見圖1，6)或在L152具有指定取代的質粒與hF8輕鏈（LC) 表達質粒。收集介質中分泌的hF8,并在轉染后48小時通過aPTT測定法對其進行測定。將 野生型人F8重鏈（hF8-HC1690)的表達/分泌設定為100%。hF8-L152HC突變體被鑒定為 在圖中的其特定氨基酸取代。如圖13所示，與野生型hF8HC相比，hF8-L152HC突變體以約 1. 4-3. 5倍更高的表達水平分泌。
[0189] 實施例9 :A108 _子VIII重鏈突奪體在293細朐中分泌的比較
[0190] 在293細胞中分別轉染質粒pAAV-CB-hF8-HC1690(攜帶人因子VIII的重鏈氨基 酸#1-745和a3序列；見圖1)或在A108具有指定取代的質粒與hF8輕鏈（LC)表達質粒。 收集介質中分泌的hF8,并在轉染后48小時通過aPTT測定法對其進行測定。hF8-A108HC 突變體被鑒定為在圖中的其特定氨基酸取代。將野生型人F8重鏈（hF8-HC1690)的表達/ 分泌設定為100%。如圖14所示，與野生型hF8HC相比，多數hF8-A108HC突變體以更高的 表達水平分泌。
[0191] 實施例10 :M147 _子VIII重鏈突奪體在293細朐中分泌的比較
[0192] 在293細胞中分別轉染質粒pAAV-CB-hF8-HC1690(攜帶人因子VIII的重鏈氨基 酸#1-745和a3序列；見圖1)或在M147具有指定取代的質粒與F8輕鏈（LC)表達質粒。 收集介質中分泌的F8,并在轉染后48小時通過hF8ELISA對其進行測定。hF8-M147HC突變 體被鑒定為在圖中的其特定氨基酸取代。將野生型人F8重鏈（hF8-HC1690)的表達/分泌 設定為100%。如圖15所示，與野生型hF8HC相比，多數hF8-M147HC突變體以更高的表達 水平分泌。
[0193] 實施例11 :在F8-/-大鼠樽銦中未檢測到針對5個突奪氨基酸的中和抗體
[0194] A1結構域中具有單一突變（Leul76Pro) WAG/Ri jYcb背景下的F8-/-大鼠以 1 X 1012病毒顆粒/每鼠施用AAV-TTR-hF8-X10。如Bethesda測定法所測定的，3只被注射 的大鼠中，兩只被證實出現針對因子VIII的鼠抗人因子VIII抑制性抗體。圖A表示在第8 周大鼠血漿中的抑制劑水平。圖B表示在抗體吸附后在上清液中保持F8的活性。為了確定 抑制性抗體是否特異性靶向5個突變氨基酸，我們使用過量的生物素化重組人F8 (1. 2 μ g Bi〇-F8)以使大鼠血漿中針對常規FVIII的抑制性抗體飽和。然后，使用30μ1鏈霉親和 素瓊脂糖通過在室溫下旋轉1小時然后在10, OOOrpm下離心2分鐘來拉下抗原-抗體復合 物。使用等效量的生物素化的BSA(Bio-BSA)作為對照。然后將200ng的來自穩定表達的 細胞系的BDD-F8-X5濃縮物加入到用Bi〇-F8或Bio-BSA預處理的大鼠血漿中。使用未經 預處理的大鼠血漿作為對照。通過單級aPTT測定法測定上清液中的F8活性。如圖15所 示，在該F8-/-大鼠模型中沒有檢測到針對五個突變氨基酸的中和抗體。
[0195] 上面的實施例表明，與野生型因子VIII相比，本發明的突變型因子VIII產品更好 地表達和/或分泌，因此它們可降低生產成本，并且在使用基因轉移載體時提高轉基因表 達水平。他們還可以允許較低的載體給藥劑量和較高的因子VIII的表達水平。
[0196] 以上描述是出于教導本領域普通技術人員如何實踐本發明的目的。它并不意欲詳 細說明對正在閱讀本說明書的技術人員來說是明顯的所有那些顯而易見的修改和變化。然 而，它意欲將所有這種顯而易見的修改和變化包括在本發明的范圍內，其由以下權利要求 所定義。權利要求意在涵蓋有效滿足預期目的的以任何順序的權利要求保護的成分和步 驟，除非上下文明確指出相反。
【主權項】
1. 一種分離的人因子VIII多肽突變體，其包括選自I86、Y105、A108、D115、Q117、F129、 G132、H134、M147和L152中的一個或多個氨基酸取代。2. 權利要求1所述的突變體，其中，所述一個或多個氨基酸取代選自I86V、Y105F、 A108S、D115E、Q117H、F129L、G132K、H134Q、M147T和L152P中。3. 權利要求 1 所述的突變體，其包括 186、Y105、A108、D115、Q117、F129、G132、H134、 M147和L152各氨基酸的氨基酸取代。4. 權利要求 3 所述的突變體，其包括I86V、Y105F、A108S、D115E、Q117H、F129L、G132K、 H134Q、M147T和L152P各氨基酸取代。5. 權利要求1所述的突變體，其中，所述一個或多個氨基酸取代選自186、A108、G132、 M147 和L152P中。6. 權利要求5所述的突變體，其中，所述一個或多個氨基酸取代選自I86V、A108S、 G132K、M147T和L152P中。7. 權利要求5所述的突變體，其包括I86、A108、G132、M147和L152各氨基酸的氨基酸 取代。8. 權利要求7所述的突變體，其包括I86V、A108S、G132K、M147T和L152P各氨基酸的 氨基酸取代。9. 權利要求1-8中任一項所述的突變體，其進一步包括人因子VIII的B結構域中的缺 失。10. 權利要求9所述的突變體，其進一步包括人因子VIII的a2和/或a3結構域。11. 一種分離的多核苷酸，其編碼權利要求1-10中任一項所述的突變體。12. -種表達載體，其包含權利要求11所述的多核苷酸。13. -種宿主細胞，其包含權利要求11所述的多核苷酸。14. 一種宿主細胞，其包含權利要求12所述的表達載體。15. -種藥物組合物，其包含權利要求14所述的表達載體。16. -種用于治療患有因子VIII缺乏的患者的方法，其包括： 向有此需要的患者施用對治療所述因子VIII缺乏有效量的權利要求15所述的藥物組 合物。17. -種表達人因子VIII多肽突變體的方法，其包括： (a) 用包含權利要求12所述的核酸的表達載體轉化宿主細胞； (b) 在適合表達人因子VIII多肽突變體的條件下使宿主細胞生長；和 (c) 從表達所述突變體的宿主細胞中純化人因子VIII多肽突變體。
【專利摘要】在一個方面，本發明提供一種相比野生型因子VIII具有增加的表達和/或分泌的重組突變型人因子VIII。在某些實施方式中，所述重組因子VIII包括選自I86、Y105、A108、D115、Q117、F129、G132、H134、M147和L152中的一個或多個氨基酸取代。在其它方面，本發明提供編碼FVIII的核酸、FVIII表達載體以及在如血友病A的FVIII缺乏的治療中使用所述修飾的FVIII基因的方法。
【IPC分類】C12N15/09, C07K14/755
【公開號】CN105431451
【申請號】CN201480035965
【發明人】肖衛東, 曹文靜, 董飚
【申請人】肖衛東
【公開日】2016年3月23日
【申請日】2014年6月24日
【公告號】EP3013855A1, US20160102133, WO2014209942A1