AV2 Cap 或亞單位。嵌合衣殼可以，例如，包括具有一個或多個B19Cap亞單位的AAV衣殼，例如，AAV Cap蛋白或亞單位可由B19Cap蛋白或亞單位替換。例如，AAV衣殼的Vp3亞單位可由B19 的Vp2亞單位替換。
[0146] 可以培養包裝細胞以產生本發明的包裝的病毒載體。包裝細胞可以包括異源的 (1)病毒載體功能、（2)包裝功能和（3)助手功能。病毒載體功能一般包括細小病毒基因組 (如AAV基因組）的一部分，具有rep和cap缺失并且由如上所述的突變型FVIII序列和與 其相關的表達控制序列替代。
[0147] 在某些實施方式中，如Samulski等人的第2004/0029106號美國專利公開所描述 的，病毒載體功能可以合適地被提供為雙鏈體載體模板。雙鏈體載體是二聚自身互補（SC) 的多核苷酸（通常是DNA)。例如，雙鏈體載體的DNA可以被選擇從而由于鏈內堿基配對形 成雙鏈發夾結構。雙鏈體DNA載體的兩條鏈可以被包裝在病毒衣殼內。雙鏈體載體提供了 可與雙鏈DNA病毒載體相媲美的功能，并且能夠減輕靶細胞合成通常由病毒殼體化的單鏈 基因組的互補DNA的需要。
[0148] 選擇用于病毒載體的TR(可分解的和不可分解的）優選是AAV序列（來自任何AAV 血清型）。可分解的AAV ITR不必具有野生型TR序列（例如，野生型序列可通過插入、缺失、 截短或錯義突變而改變），只要TR介導所期望的功能（例如，病毒包裝、整合和/或原病毒 拯救等）即可。TR可以是起到AAV反向末端重復的作用的合成序列，例如，如在Samulski 等人的第5478745號美國專利中描述的"雙D序列"。典型地，但不是必須的，所述TR來自 相同的細小病毒，例如，兩個TR序列均來自AAV2。
[0149] 包裝功能包括衣殼組分。衣殼組分優選來自細小病毒衣殼，如AAV衣殼或嵌合AAV 衣殼功能。合適的細小病毒病毒衣殼組分的實例是來自細小病毒病科（例如，自主性細小 病毒或依賴病毒）的衣殼組分。例如，衣殼組分可以選自AAV衣殼（例如，AAV1-AAV12)和 尚未鑒定的或來自非人靈長類動物來源的其它新衣殼。衣殼組分可以包括來自兩個或更多 個AAV衣殼的組分。
[0150] 在某些實施方式中，如在Rabinowitz等人的第6491907號美國專利中所述，一個 或多個VP衣殼蛋白可包含嵌合蛋白，包括來自兩個或更多個病毒（優選兩個或更多個AAV) 的氨基酸序列。例如，嵌合病毒衣殼可包括來自腺相關病毒（AAV)的衣殼區域和至少一個 來自B19病毒的衣殼區域。嵌合衣殼可以，例如，包括具有一個或多個B19衣殼亞單位的AAV 衣殼，例如，AAV衣殼亞單位可由B19衣殼亞單位替代。例如，AAV衣殼的VP1、VP2或VP3 亞單位可由B19的VP1、VP2或VP3亞單位替代。作為另一個例子，嵌合衣殼可以包括2型 AAV衣殼，其中，2型VP1亞單位已被來自1型、3型、4型、5型或6型AAV衣殼（優選3型、4 型或5型衣殼）的VP1亞單位替代。或者，嵌合細小病毒具有2型AAV衣殼，其中，2型VP2 亞單位已被來自1型、3型、4型、5型或6型AAV衣殼（優選3型、4型或5型衣殼）的VP2 亞單位替代。同樣，優選的是嵌合體細小病毒，其中，用來自1型、3型、4型、5型或6型AAV 衣殼（優選3型、4型或5型衣殼）的VP3亞單位代替2型AAV衣殼的VP3亞單位。作為 進一步的選擇，優選的是嵌合體細小病毒，其中，2型AAV亞單位中的兩個被來自不同血清 型的AAV(例如，1型、3型、4型、5型或6型AAV衣殼）的亞單位替代。在根據該實施方式 的示例性的嵌合細小病毒中，2型AAV衣殼的VP1和VP2,或者VP1和VP3,或者VP2和VP3 亞單位由不同血清型的AAV(例如，1型、3型、4型、5型或6型AAV)的相應亞單位代替。同 樣地，在其它優選實施方式中，嵌合細小病毒具有1型、3型、4型、5型或6型AAV衣殼（優 選2型、3型或5型衣殼），其中，如以上針對2型AAV所描述的，一個或兩個亞單位已替換 為來自不同血清型的AAV的那些。
[0151 ] 包裝病毒載體通常包括突變型FVIII序列和足以導致載體DNA的包裝和隨后的突 變型FVIII序列在轉導細胞中的表達的TR元件的側翼的表達控制序列。病毒載體功能可 以，例如，被提供給細胞作為質粒或擴增子的組成部分。病毒載體功能可以以染色體外的形 式存在于細胞系內和/或可被整合到細胞的染色體DNA中。
[0152] 在一個優選的實施方式中，本文所述的突變型FVIII被用于FVIII相關病癥（如 血友病A)的基因治療中。在這種情況下的，突變型FVIII轉基因的表達可以增強同時患有 由于因子VIII缺乏導致的無法控制的出血（如關節內、顱內或胃腸道出血）的受試者的凝 血，包括已出現了針對人因子VIII的抗體的血友病患者。載體的祀細胞是能夠表達具有 FVIII活性的多肽的細胞，如哺乳動物的肝臟系統的那些，內皮細胞，和具有用于加工前體 的合適的細胞結構（cellular machinery)以產生具有FVIII活性的蛋白質的其他細胞。
[0153] 在【具體實施方式】中，本發明提供了一種藥物組合物，其包含在藥學上可接受的載 體和/或其它醫藥劑、藥劑、載體、佐劑、稀釋劑等中的本發明的包括FVIII的修飾基因的載 體。
[0154] 應當向需要這種治療的患者施用的重組因子VIII的治療劑量將根據因子VIII 缺乏的嚴重程度變化。一般地，劑量水平在符合每個患者的出血事件的嚴重性和持續時間 的情況下以調整頻率、持續時間和單位調節。因此，如通過標準凝血測定法所測定的，重組 因子VIII以足以向患者遞送治療有效量的蛋白質以止血的量被包括在藥學上可接受的載 體、遞送賦形劑或穩定劑中。
[0155] 因子VIII被經典定義為修正存源自患有A型血友病的個體的血漿中的凝血缺陷 的存在于正常血漿中的物質。因子VIII的純化的和部分純化的形式的體外凝血活性被 用于計算用于人類患者注入的重組因子VIII的劑量，并且是從患者血漿恢復的活性和修 正體內出血缺陷的可靠指標。根據Lusher等人.，New Engl. J. Med. 328:453-459(1993); Pittman 等人，Blood 79:389-397(1992);和 Brinkhous 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. 82:8752-8755(1985)，在新的因子VIII分子的體外標準測定和其在狗注入模型中或 在人患者中的行為之間沒有報道差異。
[0156] 通常，通過施用重組因子VIII在患者中實現的所需的血漿因子VIII活性水平在 正常的30-200%的范圍內。在一個實施方式中，治療性重組因子VIII的施用是以優選劑 量在約5至500單位/kg體重的范圍內，且特別是在10-100單位/kg體重的范圍內的劑 量，且更特別是在20-40單位/kg體重的劑量，靜脈內給予；間隔頻率是在約8至24小時 的范圍（就嚴重受影響的血友病患者而言）；以天計的處理持續時間在1至10天或直到出 血事件得以解決的范圍內。參見，例如，Roberts, H.R.和M.R. Jones的"Hemophilia and Related Conditions-Congenital Deficiencies of Prothrombin(Factor II,Factor V，and Factors) Ch. 153, 1453-1474, 1460,由 Williams, W. J.等人編輯的血液學（1990) "。具有抑制劑的患者可能需要與其以前形式的因子VIII相比不同量的重組因子VIII。例如， 因重組因子VIII比野生型VIII更高的特異性活性及其降低的抗體反應性，患者可能需要 較少的重組因子VIII。如在用人或源自血漿的因子VIII的治療中，注入的治療性重組因子 VIII的量由一級因子VIII凝血測定法定義，并且在選擇的情況下，體內恢復是通過測量注 入后患者的血漿中的因子VIII而確定的。應當理解，對于任何特定受試者，特定的劑量方 案應根據個體需要和施用或監督組合物施用的人的專業判斷隨著經過的時間而調節，且本 文闡述的濃度范圍僅是示范性的并不意欲限制權利要求保護的重組因子VIII的范圍或實 踐。
[0157] 治療可以視需要采取重組因子VIII的單次靜脈內給藥的形式或在一段長時間內 定期或連續給藥。或者，治療性重組因子VIII可以在不同的時間間隔以一個或數個劑量與 脂質體一起皮下或口服給藥。
[0158] 對于注射，載體典型地是液體。對于給藥的其它方法，載體可以是固體或液體。對 于吸入給藥，載體將是可吸入，并且優選是以固體或液體顆粒的形式。作為注射介質中，優 選使用包含通常用于注射溶液的添加劑（如穩定劑，鹽或鹽水，和/或緩沖劑）的水。
[0159] 示例性的藥學上可接受的載體包括無菌、無熱原的水和無菌、無熱原的磷酸緩沖 鹽水。生理學上可接受的載體包括藥學上可接受的載體。藥學可接受的載體是那些不是生 物學或其它方面不理想的，即，該材料可被施用于受試者，而不會引起勝過該材料的有利的 生物效應的不希望的生物效應。（例如，在離體細胞轉染時或者在直接向受試者施用病毒載 體或細胞時）可以使用一種藥物組合物。
[0160] 包含修飾的FVIII的基因的重組病毒載體優選以生物學有效量施用到細胞中。如 果將病毒載體施用到體內細胞（例如，如下所述將病毒施用于受試者），病毒載體的生物有 效量是足以導致轉基因在靶細胞中轉導和表達的量。
[0161] 用病毒載體轉導的細胞優選以與藥物載體組合的"治療有效量"施用于受試者。本 領域技術人員將理解，治療效果不必是完全的或治愈的，只要向受試者提供一些益處即可。
[0162] 向受試者施用的細胞的劑量將隨著受試者的年齡、身體狀況和種類，細胞類型、由 細胞表達的核酸、給藥方式等變化。通常，將每劑量施用至少約1〇2至約10 8,優選約1〇3至 約10s個細胞。優選地，所述細胞將以治療有效量施用。
[0163] 向有此需要的人受試者或動物施用所述載體可以通過本領域中已知的用于施用 病毒載體的任何方法。示例性的施用方式包括直腸、經粘膜、局部、透皮、吸入、腸胃外（例 如，靜脈內、皮下、皮內、肌肉內和關節內）施用等，以及直接的組織或器官注射，或者，鞘 內、直接肌內、心室內、靜脈內、腹膜內、鼻內或眼內注射。注射劑可以常規形式制備，可以作 為液體溶液或懸浮液、適于在注射前用于溶液或液體懸浮液的固體形式。或者，可以在局部 而非全身方式施用病毒，例如，以儲庫或緩釋制劑。
[0164] 在其它優選的實施方式中，本發明的包含突變型FVIII基因的載體以肌內施用， 更優選通過肌內注射或通過局部給藥施用。本文公開的載體可以通過任何合適的手段施用 于受試者的肺，但優選通過施用包含本發明的細小病毒載體的患者吸入的可吸入顆粒的氣 霧劑懸浮液來施用。所述可吸入顆粒可以是液體或固體。如本領域技術人員所熟知的，包 含本發明的細小病毒載體的液體顆粒的氣溶膠可以通過任何合適的手段來制造，例如，使 用壓力驅動的氣霧劑噴霧器或超聲噴霧器。參見，例如，第4501729號美國專利。
[0165] 具有突變型FVIII基因的病毒載體的劑量將取決于施用方式、要治療的疾病或病 癥、個體受試者的身體狀況、具體的病毒載體以及要被遞送的基因，并且可以常規方式確 定。達到治療效果的示例性的劑量為至少為約?ο5、?ο6、?ο7、?ο 8、?ο9、?ο1'?ο11、1〇12、1〇 13、 1014、1015轉導單位以上，優選約10 8-1013轉導單位，還更優選10 12轉導單位的病毒載量。突 變型FVIII基因可以施用作為具有適合于在靶細胞中表達的調節元件的DNA分子的組成部 分。突變型FVIII基因可以施用作為病毒質粒（如rAAV載體）的組分。病毒顆粒可施用 作為單獨的病毒顆粒，無論是向門戶脈管系統體內直接遞送，還是包括將載體病毒顆粒體 外施用到來自接受治療的動物的細胞接著將轉導的細胞返回到供體的體外治療。
[0166] 本發明通過下列實施例進一步說明，這些實施例不應被解釋為對本發明的限制。 在本申請中引用的所有參考文獻、專利和公開的專利申請通過引用的方式并入本文。
[0167] 實施例1 :無 B結構域的閔子VIII突奪體的構律、表汰和純化
[0168] 質粒pAAV-CB_F8攜帶在CB啟動子（具有CMV增強子的β -肌動蛋白啟動子）控 制下的無 Β結構域的人因子VIII (hF8) cDNA。該質粒，與圖10所示的構建體一致，被用作用 于制備各種hF8突變體的模板。化學合成編碼取代突變I86V、Y105F、A108S、D115E、Q117H、 F129L、G132K、H134Q、M147T 和 L152P 的 hF8cDNA 片段并用于替換質粒 pAAV-CB-F8 的相應 區域。所得質粒（質粒PAAV-CB-F8-X10)表達具有上述10個突變的突變型因子VIII蛋白 (F8-X10 ；SEQ ID N0:3)〇
[0169] 化學合成編碼取代突變I86V、A108S、G132K、M147T、L152P的因子VIII cDNA片段 并用于替換質粒PAAV-CB-F8的相應區域。所得質粒（質粒pAAV-CB-F8-X5)表達具有上述 5個突變的突變型因子VIII蛋白（F8-X5;SEQ ID N0:4)。
[0170] 在PAAV-CB-F8質粒中使用定點誘變來引入對應于人因子VIII的186、 Y105、A108、D115、Q117、F129、G132、H134、M147、L152 的各個突變。由此產生的質 粒包括質粒 PAAV-CB-F8-I86V、質粒 pAAV-CB-F8-Y105F、質粒 pAAV-CB-F8-A108S、 質粒 PAAV-CB-F8-D115E、質粒 pAAV-CB-F8-Q117H、質粒 pAAV-CB-F8-F129L、質 粒 PAAV-CB-F8-G132K、質粒 pAAV-CB-F8-H134Q 和質粒 pAAV-CB-F8-M147T、質粒 pAAV-CB-F8-L152P〇
[0171] 也使用定點誘變來將pAAV-CB-F8-X10質粒中的hF8-X10的氨基酸86、105、108、 115、117、129、132、134、147、152的各個突變恢復為野生型人氨基酸。由此產生的質粒包括 質粒 PAAV-CB-F8-X10-V86I、質粒 pAAV-CB-F8-X10-F105Y、質粒 pAAV-CB-F8