突變型因子viii組合物和方法
【技術領域】
[0001] 本申請要求享有于2013年6月24日提交的順序號為61/838867的美國臨時專利 申請的優先權。上述申請的全部內容在此通過引用的方式并入本文。
[0002] 本發明涉及相比相應的野生型人因子VIII顯示出更高的表達水平的重組人因子 VIII突變體。本發明還涉及制備和使用重組人因子VIII突變體的方法。
[0003] 政府許可權
[0004] 本發明是在美國國立衛生研究院授予的授權號HL084381的美國政府支持下作出 的。美國政府因此對本發明具有一定許可權利。
【背景技術】
[0005] 血友病A，是最常見的嚴重的遺傳性出血性疾病，由血漿蛋白因子VIII的缺乏或 缺陷引起。在患有血友病A的患者中，當血友病患者受傷時，血液不正常凝結導致出血過 多。治療方法由使用（純化的）血漿或重組蛋白制品的替代療法組成。
[0006] 當血小板附著到受傷血管的切口壁時，在受損部位凝血開始。隨后，在酶調節的反 應的級聯中，可溶性纖維蛋白原分子通過酶凝血酶被轉變為使血小板聚集在血栓中的纖維 蛋白的不溶性絲。在級聯中的每一步，蛋白前體被轉變為在系列中切割下一個前體蛋白的 蛋白酶。在大多數步驟中需要輔因子。
[0007] 因子VIII作為非活性的非共價的金屬離子依賴性異源二聚體前體在血液中循 環，緊密和非共價地結合von Willebrand因子。蛋白質的這種procofactor形式包含由 Al(al)A2(a2)B結構域組成的重鏈（HC)和由（a3)A3ClC2結構域組成的輕鏈（IX)，小寫字 體a代表酸性殘基中富含的短（~30-40個殘基）片段。因子VIII是在由凝血酶或因 子Xa催化的A1A2、A2B和A3A3結點通過溶蛋白性裂解而蛋白水解活化的，這用來使其與 von Willebrand因子分離并在級聯中活化其促凝血功能。在其活性形式，所述蛋白質因子 Villa是在酶原因子X向絲氨酸蛋白酶（因子Xa)的膜依賴性轉變中將絲氨酸蛋白酶因子 IXa的催化效率以幾個數量級增加的輔因子。
[0008] 基因療法已經被提出作為治療方式用于補充在血友病患者中的凝血因子缺乏， 并且已經嘗試設計適合于治療人類的FVIII構建體。例如，Connelly等人報道用編碼人 FVIII的腺病毒載體治療FVIII缺乏小鼠導致生物活性的人FVIII的表達（Connelly等人， Blood，第91卷，第9期（1998)，第3273-3281頁）。Sarkar等人報道在小鼠模型中與FVIII 組合使用AAV8血清型修正血漿FVIII活性（Sarkar等人，Blood，第103卷，第4期（2004)， 第 1253 至 1260 頁）。
[0009] 然而，如在基因療法的許多方面中，理論要比成功有效的實施簡單得多。實施基因 療法技術的困難包括在使用病毒作為基因載體和FVIII的表達水平不足所遇到的問題。例 如，人FVIII分泌非常低效且產率相比相似的蛋白質（如因子V)以對數形式降低。此外， 雖然病毒作為基因載體是有效的，因為它們可以用于轉導細胞導致體內蛋白質表達，但是 包被病毒顆粒的蛋白質可以激活機體的免疫系統。
[0010] 因此，鑒于上述情況，需要可以有效地表達足夠量的靶FVIII蛋白以將病毒載體 的所需劑量減少到可接受的水平。
【發明內容】
[0011] 概要
[0012] 本發明提供修飾的因子VIII(FVIII)蛋白、編碼FVIII的核酸和FVIII表達載體， 以及在FVIII缺乏（如血友病A)的治療中使用所述修飾的FVIII基因的方法。
[0013] 在一個方面，本發明提供了一種相比野生型因子VIII具有增加的表達或分泌的 突變型人因子VIII。
[0014] 在一個實施方式中，所述重組突變型人因子VIII包括選自I86、Y105、A108、D115、 Q117、F129、G132、H134、M147、L152和其組合中的一個或多個氨基酸取代。
[0015] 在另一個實施方式中，所述重組突變型人因子VIII包括選自I86V、Y105F、A108S、 D115E、Q117H、F129L、G132K、H134Q、M147T、L152P和其組合中的一個或多個氨基酸取代。
[0016] 在另一個實施方式中，所述重組突變型人因子VIII包括186、Y105、A108、D115、 Q117、F129、G132、H134、M147和L152各氨基酸的氨基酸取代。
[0017] 在另一個實施方式中，所述重組突變型人因子VIII包括I86V、Y105F、A108S、 D115E、Q117H、F129L、G132K、H134Q、M147T 和 L152P 氨基酸取代。
[0018] 在另一個實施方式中，所述重組突變型人因子VIII包括選自186、A108、G132、 M147、L152和其組合中的一個或多個氨基酸取代。
[0019] 在另一個實施方式中，所述重組突變型人因子VIII包括選自I86V、A108S、G132K、 M147T、L152P和其組合中的一個或多個氨基酸取代。
[0020] 在另一個實施方式中，所述重組突變型人因子VIII包括I86V、A108S、G132K、 M147T和L152P各自的氨基酸取代。
[0021] 在另一個實施方式中，所述重組突變型人因子VIII包括氨基酸取代I86V、A108S、 G132K、M147T 和 L152P。
[0022] 在其他實施方式中，所述人因子VIII突變體還包括在人因子VIII的B結構域中 的缺失。
[0023] 在其他實施方式中，所述人因子VIII突變體還包括人因子VIII的a2和/或a3 結構域。
[0024] 在另一個方面，本發明提供了分離的多核苷酸序列，其編碼本文描述的人因子 VIII突變體。
[0025] 在又一個方面，本發明提供了可操作地連接編碼本文描述的人因子VIII突變體 的多核苷酸的表達載體。
[0026] 在進一步的方面，本發明提供了一種藥物組合物，其包含可操作地連接編碼本文 描述的人因子VIII突變體的多核苷酸的表達載體。
[0027] 在另一個方面，本發明提供了一種用于治療患有因子VIII缺乏的患者的方法，其 包括向有此需要的患者施用對治療所述因子VIII缺乏有效量的含有可操作地連接編碼本 文描述的人因子VIII突變體的多核苷酸的表達載體的藥物組合物。
[0028] 在另一個方面，本發明提供了一種表達人因子VIII多肽突變體的方法，其包括： (a)用可操作地連接編碼根據本發明的人因子VIII突變體的多核苷酸的表達載體轉化宿 主細胞；(b)在適合表達人因子VIII多肽突變體的條件下使宿主細胞生長；和（c)從表達 所述突變體的宿主細胞中純化人因子VIII多肽突變體。
【附圖說明】
[0029] 圖1示出了人因子VIII重和輕鏈的結構域，包括本發明中所用的幾個重鏈結構。
[0030] 圖2是顯示與具有10個示例性的取代以增強分泌的經修飾的因子VIII并排的分 泌的人因子VIII重鏈的前200個氨基酸的排列的圖。
[0031] 圖3是顯示與具有5個示例性的取代以增強分泌的經修飾的人因子VIII并排的 分泌的人因子VIII重鏈的前200個氨基酸的排列的圖。
[0032] 圖4總結了確定為影響人因子VIII分泌的示例性氨基酸。
[0033] 圖5和圖6描繪了示例性的用于表達B結構域缺失的人因子VIII突變體或人因 子VIII重鏈的AAV載體。
[0034] 圖7顯示了在BHK細胞（圖A)或293細胞（圖B)中不同的人因子VIII突變體 的分泌的比較。
[0035] 圖8顯示了在體內就分泌而言不同的人因子VIII突變體的分泌的比較。將質粒 pAAV-CB-hBDDF8 (攜帶B結構域缺失的人因子VIII)、質粒pAAV-CB-hBDDF8-X10 (攜帶具有 10個取代的hF8-BDD)、質粒pAAV-CB-hBDD-F8-X5 (攜帶具有5個取代的hBDDF8)或質粒 pAAV-CB-hBDD-F8-G312K(具有G132K取代的hF8)注射于因子VIII雙基因敲除Blab/c小 ￡3 邱U
[0036] 圖9顯示了在293細胞中不同的人因子VIII突變體分泌的比較。hBDD-F8-X10 中的氨基酸被恢復到其相應的野生型氨基酸。在hBDD-F8-X10-6p中，不同于野生型F8的 hBDD-F8-X10中的10個氨基酸中的6個被恢復到它們的野生型氨基酸。
[0037] 圖10顯示了在AAV載體構建體中的突變體因子VIII(F8)重鏈（HC1690-X10)與 野生型hF8-HC1690AAV載體構建體（AAV/hF8HC1690)在體內的表達和分泌的比較。
[0038] 圖11顯示了在293細胞中不同的G132因子VIII重鏈突變體的分泌的比較。
[0039] 圖12顯示了在因子VIII雙基因敲除Blab/c小鼠中就表達/分泌而言不同的因 子VIII的重鏈突變體的分泌的比較。
[0040] 圖13顯示了在293細胞中不同的L152因子VIII重鏈突變體的分泌的比較。
[0041] 圖14顯示了在293細胞中不同的A108因子VIII重鏈突變體的分泌的比較。
[0042] 圖15顯示了在293細胞中不同的M147因子VIII重鏈突變體的分泌的比較。
[0043] 圖16顯示了在F8-/-大鼠模型中沒有形成針對5個突變氨基酸的中和抗體。
【具體實施方式】
[0044] 詳細說明
[0045] 有關本發明的生物分子的各種術語的定義同上，也可用于整個說明書和權利要求 書。
[0046] 短語"分泌增強因子VIII (seFVIII，seF8) "是指一種修飾的FVIII (F8)，其已被遺 傳改變使得所編碼的蛋白質在與未經修飾的FVIII相比時表現出至少10%或20%或50% 或100%的在分泌方面的增長。本文描述的核苷酸序列可容易地從GenBank中獲得。對于 人FVIII，請見登錄號NG-011403. 1。
[0047] 短語"BDD"指的是缺少B結構域的"無 B結構域"因子VIII (F8或FVIII)突變體。
[0048] 短語"一個或多個"，后跟要素或種類的列表，旨在包含列表中的要素或種類的任 何排列。因此，例如，短語"選自A、B、C、D、E和F中的一個或多個取代突變"可以包括含有 A、B、C、D、E和/或F的取代突變的任何組合。
[0049] 如本文所用，范圍可以表示為從一個特定整數值至另一個特定整數值。在表達這 樣的范圍時，應當理解的是，在此范圍內的任一和全部整數值定義了根據本發明的單獨的 實施方式，并且實施方式的全部范圍包括在所述范圍內進一步包括在最初范圍中的整數值 的任何配對之間的任一和全部子范圍。
[0050] 關于本發明的核酸，術語"分離的核酸"，在應用于DNA時，指的是一種DNA分子， 所述DNA分子與其從中起源的生物體的天然存在的基因組中的與它緊鄰的（在5'和3'方 向）序列分離。例如，"分離的核酸"可以包括插入到載體（如質粒或病毒載體）中的DNA 或cDNA分子，或整合到原核生物或真核生物的DNA。核酸密碼子可被最優化以增強在哺乳 動物細胞中的表達。
[0051 ] 對于本發明的RNA分子，術語"分離的核酸"主要是指由如上定義的分離的DNA分 子編碼的RNA分子。或者，該術語可以指的是一種RNA分子，所述RNA分子已充分地與在天 然狀態下（即，在細胞或組織中）將會與它相關的RNA分子分離，使得它以"基本上純的"的 形式存在（術語"基本上純的"在下面定義）。
[0052] 對于蛋白質，術語"分離的蛋白質"或"分離和純化的蛋白質"有時也用于本發明。 此術語主要是指由本發明的分離的核酸分子的表達產生的蛋白質。或者，該術語可指已充 分地與會與它天然相關的其它蛋白質分離以便以"基本上純的"形式存在的蛋白質。
[0053] 術語"啟動子區域"是指基因的轉錄調節區，其可在編碼區的5'或3'側、或在編 碼區內、或內含子中找到。
[0054] 術語"載體"是指一種小載體DNA分子，DNA序列可被插入其中以引入到宿主細胞 中，在宿主細胞中其將被復制。"表達載體"是包含具有在宿主細胞中表達所需要的必要調 節區的基因或核酸序列的專用載體。
[0055] 術語"可操作地連接"是指編碼序列表達所必需的調節序列置于相對于所述編碼 序列的適當位置上的DNA分子中，以便實現編碼序列的表達。此相同的定義有時應用于表 達載體中的編碼序列和轉錄控制元件（例如，啟動子、增強子和終止元件）的排列。此定義 有時也應用于第一和第二核酸分子的核酸序列的排列，其中產生雜種核酸分子。
[0056] 術語"基本上純的"是指包含至少50-60重量％的目的化合物（例如，核酸、寡核 苷酸、蛋白質等）的制品。更優選地，所述制品包含至少75重量％且最優選90-99重量％ 的目的化合物。純度通過適合于所述目的化合物的方法（例如，色譜法、瓊脂糖或聚丙烯酰 胺凝膠電泳、HPLC分析等）測定。
[0057] "基本上由…組成"一詞，在指特定核苷酸序列或氨基酸序列時，指的是具有給定 序列號（SEQ ID N0)的屬性的序列。例如，在用于參照氨基酸序列時，該詞包括序列本身和 將不會影響序列的基本和新穎特征的分子修飾。
[0058] 本文所用術語"寡核苷酸"是指本發明的引物和探針，并且被定義為由兩個或多個 核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸（優選超過三個）組成的核酸分子。寡核苷酸的準確尺寸 將取決于各種因素，并且取決于使用寡核苷酸的特定應用。如本文所用的術語"探針"是指 寡核苷酸、多核苷酸或核酸，無論是RNA或DNA，無論是如在純化的限制性酶消化中自然存 在的或是合成產生的，所述探針能夠與具有與所述探針互補的序列的核酸退火或特異性雜 交。探針可以是單鏈的或雙鏈的。探針的確切長度將取決于許多因素，包括溫度、探針的來 源和使用方法。例如，對于診斷應用，根據靶序列的復雜性，寡核苷酸探針通常含有15-25 個或更多個核苷酸，盡管它可含有更少的核苷酸。
[0059] 本文所用術語"百分比相同"參考核酸或氨基酸序列之間的比較。核酸和