105、A108、D115、Q117、F129、G132、H134、M147 和 / 或 L152 處的一個或多個取代進一步修 飾的已增加了在培養基中的分泌的因子VIII的核苷酸序列。
[0120] 在進一步的實施方式中，所述分離的核酸分子可以具有編碼連同在位置186、 Y105、A108、D115、Q117、F129、G132、H134、M147 和 / 或 L152 處的一個或多個取代一起的具 有一個或多個非天然發生的糖基化位點的因子VIII的核苷酸序列。
[0121] 在又一個實施方式中，所述分離的核酸分子編碼用在位置186、Y105、A108、D115、 Q117、F129、G132、H134、M147和/或L152處的一個或多個取代修飾并且進一步修飾成具有 下列修飾中的任何組合的重組因子VIII :修飾成無 B結構域的、修飾成嵌合的、修飾成具有 融合的A2-A3結構域、修飾成具有一個或多個改變的失活裂解位點的、修飾成具有增強的 因子IXa和/或因子X的親合力的、修飾成具有提高的分泌的、修飾成具有增加的循環半衰 期的以及修飾成具有一個或多個非天然發生的糖基化位點的。
[0122] 本發明的另一個方面涉及一種用于表達本文描述的突變型因子VIII多核苷酸的 表達載體。如本文所用，術語"表達載體"是指一種病毒或非病毒載體，其以適合于在宿主 細胞中表達多核苷酸的形式包含編碼本發明的新肽的多核苷酸。一種類型的非病毒的載體 是"質粒"，質粒包括可以連接另外的DNA片段到其中的環狀雙鏈DNA環。另外，在本說明書 中，"質粒"和"載體"可以互換使用，因為質粒是最常用的載體形式。
[0123] 當制備表達載體時，可以將轉基因序列插入到含有用于在細菌以及真核細胞中復 制的合適細菌序列的質粒。可以使用任何方便的質粒，所述質粒可以包括允許在細菌中選 擇的標記以及通常一個或多個獨特的、便利的定位的限制性位點。載體的選擇將取決于優 選的轉化技術和轉化用的靶宿主。
[0124] 用于表達突變型因子VIII多肽的表達載體包括一個或多個可操作地連接到待表 達的多核苷酸序列的調節序列。本領域的技術人員將理解，表達載體的設計可取決于如待 轉化的宿主細胞的選擇、所需的蛋白質的表達水平等的這樣的因素。本發明的表達載體可 以被引入宿主細胞，從而制得本文描述的突變型因子VIII蛋白。
[0125] 如本文所使用的，術語"控制序列"或"調節序列"指可操作連接的編碼序列在特 定宿主生物體中的表達所必需的DNA序列。術語"控制/調節序列"旨在包括啟動子、增強 子和其他表達控制元件（例如，多腺苷酸化信號）。控制/調節序列包括在許多類型的宿主 細胞中指導核苷酸序列的組成型表達的那些和僅在某些宿主細胞中指導核苷酸序列的表 達的那些（例如，組織特異性調節序列）。
[0126] 當將一個核酸序列置于與另一個核酸序列的功能關系中時，所述一個核酸序列 "可操作地連接"到所述另一個核酸序列。例如，將前序列或分泌前導肽的DNA可操作地連 接到多肽的DNA，如果它表達為參與該多肽的分泌的前蛋白；將啟動子或增強子可操作地 連接到編碼序列，如果它影響序列的轉錄；或者將核糖體結合位點可操作地連接到編碼序 列，如果它被定位以便促進翻譯。通常，"可操作連接"意味著被連接的DNA序列是鄰接的， 并且在分泌前導的情況下是鄰接的且處于閱讀狀態。然而，增強子不必是鄰接的。連接是 通過在方便的限制性位點連接來完成。如果此類位點不存在，依照常規實踐使用合成的寡 核苷酸接頭或連接體。
[0127] 用于指導在哺乳動物細胞中表達的合適的表達載體通常包括啟動子，以及本領域 中已知的其它轉錄和翻譯控制序列。在某些實施方式中，哺乳動物表達載體能夠指導多核 苷酸優先在特定細胞類型中表達（例如，組織特異性調節元件用于表達多核苷酸）。組織特 異性調節元件是本領域已知的并且可以包括，例如，肝細胞特異性啟動子和/或增強子（例 如，白蛋白啟動子、α-l抗胰蛋白酶啟動子、載脂蛋白E增強子）。或者，可以使用在幾乎任 何細胞類型中都有活性的組成型啟動子（例如，人巨細胞病毒）。
[0128] 在某些優選的實施方式中，表達載體是病毒載體。病毒載體的一個或多個病毒基 因通常已被移除，并且病毒載體包括插入到用于插入外源轉基因（包括本文描述的突變型 因子VIII)的病毒基因組插入位點的基因/啟動子盒。被移除的基因的必要的功能可以由 已被工程化以表達的轉基因中早期基因的基因產物的細胞系提供。示例性的病毒載體包 括，但不限于，腺相關病毒（AAV)載體，逆轉錄病毒載體，包括慢病毒載體、腺病毒載體、皰 疹病毒載體和甲病毒載體。其他病毒載體包括星狀病毒、冠狀病毒、正粘病毒、乳多空病毒、 副粘病毒、細小病毒、微小核糖核酸病毒、痘病毒、披膜病毒載體等。病毒載體可包括任何合 適的核酸構建體，如DNA或RNA構建體，并且可以是單鏈、雙鏈或雙螺旋。
[0129] -旦在本發明的DNA構建體已被制備，它已準備好被引入到宿主細胞中。因此，本 發明的另一個方面涉及制備包含因子VIII核酸的重組細胞的方法。基本上，這需要通過轉 化、轉導、電穿孔、磷酸鈣沉淀、脂質體等將DNA構建體引入到細胞，以及選擇已引入的DNA 以游離型或整合到宿主基因組中的細胞。
[0130] 因此，本發明的另一個方面涉及包含編碼本發明的重組因子VIII的分離的核酸 分子的宿主細胞。所述宿主細胞可以包含分離的核酸分子作為以游離質粒或穩定整合到 宿主細胞基因組中的形式的DNA分子。此外，宿主細胞可以構成用于產生重組突變型因 子VIII蛋白質的表達系統。合適的宿主細胞可以是，但不限于，動物細胞（例如，幼倉鼠 腎（"ΒΗΚ"）細胞）、中國倉鼠卵巢細胞（"CH0"）、細菌細胞（如大腸桿菌）、昆蟲細胞 (例如，Sf9細胞）、真菌細胞、酵母細胞（例如，酵母屬（Saccharomyces)或裂殖酵母屬 (Schizosaccharomyces))、植物細胞（例如，擬南芥屬或煙草細胞）、藻類細胞等。
[0131] 本發明的另一個方面涉及制備本發明的重組因子VIII的方法。此方法包括使本 發明的宿主細胞在由此所述宿主細胞表達重組因子VIII的條件下生長。然后，將所述重組 因子VIII分離。在一個實施方式中，宿主細胞在生長培養基中于體外生長。在一個具體的 實施方式中，合適的生長培養基可以包括，但不限于，含有von Willebrand因子的（本文中 稱為"VWF"）的生長培養基。在這個實施方式中，宿主細胞可以包含編碼VWF的轉基因，或 者可以將VWF引入到生長培養基中作為補充。在生長培養基中的VWF將允許重組因子VIII 的更高表達水平。一旦重組因子VIII被分泌到生長培養基中，可以利用相關的重組DNA和 蛋白質領域中的普通技術人員公知的技術（包括本文所述的那些）將其從生長培養基中分 離。在另一個實施方式中，制備本發明的重組因子VIII的方法進一步包括在分離所述重組 因子VIII之前破壞宿主細胞。在此實施方式中，從細胞碎片中分離重組因子VIII。
[0132] 當重組產生時，所述因子VIII蛋白質或多肽（或其片段或突變體）在重組宿主細 胞（典型地，但不是排他地，真核生物）中表達。在某些優選的實施方式中，真核宿主細胞 (如哺乳動物細胞）用于產生如本文所述的突變型因子VIII多肽。適合用于實施本發明的 哺乳動物細胞包括，但不限于：C0S細胞（例如，ATCC No. CRL 1650或1651)，BHK細胞（例 如，ATCC No.CRL 6281)，CH0 細胞（ATCC No.CCL 61)，HeLa 細胞（如，ATCC No.CCL 2)，293 細胞（ATCC No. 1573)，CHOP 細胞和 NS-1 細胞。
[0133] 本發明的另一個方面涉及用于治療患有因子VIII缺乏的患者的方法。在一個實 施方式中，這涉及向有此需要的患者施用對治療所述因子VIII缺乏有效量的（如本文所述 的）重組突變型因子VIII。
[0134] 在一個具體的實施方式中，根據相同的用于注入人或動物因子VIII的程序，將重 組因子VIII單獨地或者以藥物組合物的形式（即，與穩定劑、遞送賦形劑和/或載體組合） 靜脈內注入患者體內。重組因子VIII的合適的有效量可以包括，但不限于，約10至約500 單位/千克患者體重。
[0135] 在另一個實施方式中，治療患有因子VIII缺乏的患者的方法包括向有此需要 的的患者施用對治療所述因子VIII缺乏有效量的包含編碼突變型因子VIII或其功能 片段的表達載體的藥物組合物。在某些實施方式中，重組因子VIII可以通過移植經遺 傳改造以產生重組因子VIII的細胞（通常經由含有這樣的細胞的裝置的植入）來施 用。這種移植通常包括使用重組皮膚成纖維細胞的非病毒方法（Roth等人，New Engl. J. Med. 344:1735-1742(2001))。
[0136] 向因子VIII缺乏的患者施用編碼FVIII的表達載體可導致FVIII多肽的足夠的 表達以在功能上重建凝血連鎖。表達載體可以單獨使用或與在藥學上可接受的或生物相容 的組合物中的其它治療劑組合使用。
[0137] 所述編碼FVIII的多核苷酸可以用作含有重鏈和輕鏈部分的單鏈分子（圖10)或 在用于遞送到患者的宿主細胞的病毒或非病毒載體中分成兩個或多個分子（如，重鏈和輕 鏈；圖11)。
[0138] 在本發明的一個優選實施方式中，包含編碼突變型FVIII突變體的核酸序列的表 達載體是病毒載體。可在本發明中使用的病毒載體包括，但不限于，腺病毒載體（具有或不 具有組織特異性啟動子/增強子），多種血清型的腺相關病毒（AAV)載體（例如AAV-1至 AAV-12等）和雜種AAV載體，慢病毒載體和偽類型慢病毒載體[例如，埃博拉病毒、水泡性 口炎病毒（VSV)和貓免疫缺陷病毒（FIV)]，單純皰疹病毒載體，牛痘病毒載體，逆轉錄病毒 載體，慢病毒載體，非病毒載體等。
[0139] 在某些優選的實施方式中，提供了用于施用包含編碼突變型FVIII或其功能片段 核酸序列的病毒載體的方法，其包括使用AAV載體或慢病毒載體。最優選地，分別僅包括載 體的主要部分（例如，ITR和LTR元件）。直接遞送載體或離體轉導人類細胞接著注入體內 將導致突變型FVIII的表達，從而通過增強促凝血活性發揮對止血的有益治療效果。
[0140] 重組AAV載體和慢病毒載體已發現對各種基因治療應用具有廣泛的效用。其對這 些應用的效用主要是由于在各種器官背景下取得的體內基因轉移的高效率。AAV和慢病毒 顆粒可有利地使用作為進行有效的基因遞送的載體。這樣的病毒粒子對于這樣的應用具有 許多理想的特性，包括分裂和不分裂細胞的向性。用這些載體的早期臨床經驗還沒有表現 出持續的毒性，并且免疫反應甚微或測不出。已知AAV通過受體介導的胞吞作用或通過胞 轉而感染體內和體外的各種各樣的細胞類型。這些載體系統已在靶向人類的視網膜上皮、 肝、骨骼肌、呼吸道、腦、關節和造血干細胞中進行了測試。它很可能是基于質粒DNA或小環 的非病毒載體也將是對于如編碼FVIII的大基因合適的基因轉移載體。
[0141] 所期望的是引入能夠提供，例如，期望的基因的足夠表達和最小的免疫原性 的載體。改良的AAV和慢病毒載體和生產這種載體的方法已經詳細描述在許多參考 文獻、專利和專利申請中，包括描述生產臨床級載體的Wright J.F. (Hum Gene Ther 20:698-706, 2009)。慢病毒載體可以在CHOP生產，并且其他載體可以購自NHLBI基因治療 資源計劃（GTRP)-慢病毒載體生產核心實驗室的慢病毒載體生產核心實驗室。
[0142] 對于一些應用，表達構建體可以進一步包括用于驅動在特定細胞或組織類型中表 達的調節元件。這樣的調節元件對本領域技術人員來說是公知的并且在Sambrook等人 (1989)和Ausubel等人（1992)中深度討論。在本發明的表達構建體中引入組織特異性調 控元件提供了至少部分的用于表達突變型FVIII或其功能片段的組織嗜性。例如，編碼在 巨細胞病毒（CMV)啟動子控制下的突變型FVIII的核酸序列可用于骨骼肌表達或用于肝特 異性表達的hAAT-ApoE等。在慢病毒載體中的造血特異性啟動子也可以有利地用于本發明 的方法。
[0143] 在一個優選的實施方式中，提供突變型FVIII序列作為在衣殼中包裝的病毒載體 的組分。在一個特別優選的實施方式中，AAV載體用于在體內遞送突變型FVIII (Gnatenko 等人，Br.J. Haematol. 104:27-36(1999))。在這種情況下，AAV載體包括至少一個突變型 FVIII和用于控制該突變型FVIII序列的表達的相關表達控制序列。如圖10和圖11所示， 示例性的用于表達突變型FVIII序列AAV載體可包括用于FVIII表達的啟動子-增強子調 節區和起到確保促進復制以及將突變型FVIII核酸包裝入AAV衣殼并將突變型FVIII核酸 整合到靶細胞基因組中的作用的順式作用的ITR。優選地，所述AAV載體具有rep和cap基 因缺失，并由突變型hFVIII序列和與其相關的表達控制序列代替。如圖10和圖11所示， 所述突變型FVIII序列通常被插入與對病毒復制足夠的一個或兩個（即，側翼的）AAV TR 或TR元件相鄰。也可以包括其他的適合于促進突變型hFVIII序列在靶細胞中的組織特異 性表達的調節序列。
[0144] 包裝的病毒載體的病毒衣殼組分可以是細小病毒衣殼。AAV Cap和嵌合衣殼是優 選的。合適的細小病毒病毒衣殼組分的實例是來自細小病毒家族（例如，自主性細小病毒 或依賴病毒）的衣殼組件。例如，病毒衣殼可以是AAV衣殼（例如，AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、 AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV 9、AAV10、AAV11或AAV12衣殼；本領域技術人員將知道存在有 可能執行相同或相似功能的尚未確定的其它變體）或者可以包括來自兩個或更多個AAV衣 殼的組分。AAVCap蛋白質的完整補體包括VP1、VP2和VP3。包含編碼AAVVP衣殼蛋白的 核昔酸序列的0RF可包含小于完整補體AAV Cap蛋白，或者可以提供AAV Cap蛋白的完整 補體。
[0145] 如在Rabinowitz等人的第6491907號美國專利中所述，在一個或多個所述AAV Cap蛋白可以是嵌合蛋白，包括來自兩個或更多個病毒（優選兩個或更多個AAV)的氨基酸 序列AAV Cap。例如，嵌合病毒衣殼可以包括AAVICap蛋白或亞單位和至少一個A