時固定那些以 前的設置。
[0302] 結果：結果（圖14Α)表明，直接穩定性的第3個月的時間點具有84. 52%的活力， 而加速條件具有79. 02%。
[0303] 在第3個月時間點的解凍后的增殖
[0304] 加速穩定性培養條件：在Τ-25燒瓶（n= 3)、ρ= 0. 0991、1Κ接種密度、收獲培養 期（第8天）下，進行解凍后的增殖研究。直接穩定性培養條件：在Τ-25燒瓶（η= 3)、 **ρ〈0. 001、1Κ接種下，進行解凍后的增殖研究。對照表示相同批次并且以常規標準程序冷 凍保存的BM-MSC的1百萬個細胞小瓶（冷凍小瓶（cryo-vial))的解凍后的增殖。總體結 果表明，與加速條件、收獲培養期：第8天相比，解凍后的增殖率和產率在直接穩性中更高。
[0305] 結果：與加速穩定性相比，直接穩定性研究的解凍后的增殖（圖14B)已經示出了 更好的活力。
[0306] 加速過程和直接穩定過程的CFU-F測定
[0307] 方案：對于CFU-F測定，將來自直接穩定性研究小瓶和加速穩定性小瓶（每個條件 η = 2)的100個MSC鋪板在100mm2的細胞培養皿上。在溫育14天之后，用結晶紫染色平 板，并且計數可見克隆。
[0308] 結果：即使在21天時間點，加速條件的CFU-F也不能夠示出任何克隆（圖14C)。
[0309] 三譜系潛能研究
[0310] 方案：通過用10SM的地塞米松（Sigma-Aldrich)、30μg/mL的抗壞血酸 (Sigma-Aldrich)和 10mM的β-甘油磷酸酯（Sigma-Aldrich)補充細胞 3 周，誘導BM-MSC 的成骨細胞分化。通過VonKossa染色，評估鈣累積。將分化的細胞用PBS洗滌并且用10% 的福爾馬林固定30分鐘。在UV光下，將固定的細胞用5 %的AgN03溫育60分鐘，并且然后， 用2. 5%的硫代硫酸鈉處理5分鐘并且捕獲圖像。
[0311] 方案：為了誘導脂肪形成的分化，用1μΜ的地塞米松、0.5mM的異丁基甲基 黃噪呤、1μg/mL的胰島素和100μΜ的吲噪美辛（諱甲新，indomethacin)(全部來自 Sigma-Aldrich)補充BM-MSC持續21天。然后，吸取上清液，并且將細胞固定在10%的福 爾馬林中持續20分鐘。進一步地，添加200μ1的油紅0染色溶液，并且在室溫下溫育10 分鐘。將細胞用蒸餾水清洗五次并且捕獲圖像。
[0312] 方案：為了誘導軟骨形成的分化，將直接穩定性和加速穩定性小瓶的BM-MSC培養 在STEMPROdnvitrogen)軟骨形成分化培養基（具有軟骨形成補充物的軟骨細胞分化基礎 培養基）中。每隔3天，補充軟骨形成分化培養基。為了染色，將細胞用4%的福爾馬林固 定30分鐘。添加番紅0染色溶液并且溫育5分鐘。將細胞用蒸餾水清洗并且捕獲圖像。使 用NikonEclipse90i顯微鏡（NikonCorporation,Japan,www.nikon.com)和Image-Pro Express軟件（MediaCybernetics,Inc,SilverSpring，MD，www.mediacy.com),捕獲朝向 骨形成、軟骨形成和脂肪形成分化的BM-MSC圖像。
[0313] 總結：可以觀察到的是，在7AAD、CFU-F方面，與加速穩定性相比，直接穩定性研究 示出了更高的活力以及與加速條件相比多譜系分化能力。
[0314] 結果：與加速穩定性相比，直接穩定性研究的解凍后的增殖（圖14D)顯示為更好。
【主權項】
1. 一種用于培養間質基質細胞的方法，所述方法包括以下動作： a.在包括堿性成纖維細胞生長因子bFGF的培養基存在下，允許培養直至第一預定傳 代的所述間質基質細胞擴增至第二預定傳代； 其中，當所述細胞實現至少一個預定匯合時，通過使所述細胞與所述培養基接觸進行 所述擴增；并且其中，當與所述第一預定傳代的細胞數目相比，所述方法在所述第二預定傳 代結束時使所述細胞的數目增加了 2000倍。2. 根據權利要求1所述的方法，其中，所述細胞數目的增加發生在21天的最大周期中。3. 根據權利要求1所述的方法，其中，通過連續傳代，允許所述第一預定傳代的細胞擴 增至所述第二預定傳代；并且其中，所述第一預定傳代范圍從傳代2次至傳代9次；并且， 所述第二預定傳代范圍從傳代5次至傳代10次。4. 根據權利要求1所述的方法，其中，所述第一預定傳代是傳代3次；并且，所述第二 預定傳代是傳代5次。5. 根據權利要求1所述的方法，其中，用于所述擴增的接種的細胞數目范圍從約60萬 至約70萬個細胞；并且，在所述擴增之后獲得的細胞數目是至少約18億個細胞；并且其 中，所述方法使所述細胞的數目增加了至少2000倍。6. 根據權利要求1所述的方法，其中，所述培養基的組分是濃度范圍從約75%至95% 的Dulbecco改良的Eagle培養基-KnockOut，即，DMEM-KO;濃度范圍從約5%至15%的胎牛 血清，即？83;濃度范圍從約0.5%至2%的谷氨酰胺；具有約501]/1111至約1001]/1111濃度的青 霉素和約50μg/ml至約100μg/ml濃度的鏈霉素的青鏈霉素；以及濃度范圍從約0. 5ng/ ml至5ng/ml的堿性成纖維細胞生長因子，即bFGF。7. 根據權利要求6所述的方法，其中，以避免體積誤差并且提供所述bFGF在所述培養 基的多個等分部分中均勻分布的方式，通過母液混合所述組分的方法制備所述培養基，所 述方法包括以下動作： a. 制備X升包含所述DMEM-KO、FBS、谷氨酰胺和青鏈霉素，缺乏bFGF的所述培養基，并 且分配在X個1升容器中并且將所述容器從1至X標記； b. 從容器1號中取出Zml的培養基，并且分配到標記號為X+1的新無菌容器中； c. 將預定量的bFGF添加至1升減（-)Zml的容器1號的培養基，并且充分地混合以獲 得bFGF母液混合物； d. 從標記為2至X的所述容器的每個中單獨地取出等量的培養基，并且將所述Zml的 培養基添加至容器號X+1，從而使得容器號X+1的總培養基體積為Bml;以及 e. 單獨地取出預定量的步驟c中獲得的bFGF母液混合物，并且在容器2至X中各自添 加Bml培養基，從而使得每個所述容器中的體積相等，并且制備所述培養基的多個等分部 分。8. 根據權利要求7所述的方法，其中，步驟c中的bFGF的所述預定量范圍從約lng/ml 至約3ng/ml的所述培養基，優選地，約2ng/ml的所述培養基。9. 根據權利要求7所述的方法，其中，在步驟d中，以在完成所述步驟d之后，所述容器 2至X和X+1中的每一個包含等量培養基的方式，取出等量的所述培養基。10. 根據權利要求7所述的方法，其中，在步驟e中，以在完成所述步驟e之后，所述容 器2至X和X+1中的每一個包含1L培養基的方式，添加所述預定量的所述bFGF。11. 根據權利要求1所述的方法，其中，所述至少一個預定匯合選自包括約30%至約 40%、約40%至約50%、以及約60%至約70%、或它們的任何組合的匯合范圍。12. 根據權利要求1所述的方法，其中，通過使所述細胞與所述培養基接觸的所述擴增 包括以下動作： a. 通過以范圍從約1000個細胞/cm2至約7000個細胞/cm2的接種密度接種所述細胞 并且將所述培養基提供給所述接種的細胞，將所述培養的細胞擴增成連續傳代；以及 b. 允許所述細胞達到約40 %至約50 %的預定匯合，并且更換所述培養基以獲得所述 擴增的細胞； 其中，整個所述擴增中使用的所述培養基濃度范圍從約0. 15ml/cm2至約0. 35ml/cm2。13. 根據權利要求12所述的方法，其中，所述擴增使細胞數目增加了至少30倍。14. 根據權利要求1所述的方法，其中，通過使所述細胞與所述培養基接觸的所述擴增 包括以下動作： a. 通過在范圍從約1000個細胞/cm2至約7000個細胞/cm2的接種密度接種所述細胞 并且將所述培養基提供給所述接種的細胞，將所述培養的細胞擴增成連續傳代； b. 允許所述細胞達到約30 %至約40 %的預定匯合，并且在沒有除去所述消耗培養基 的情況下，將所述培養基添加至所述細胞；以及 c. 允許所述細胞達到約60 %至約70 %的第二預定匯合，并且更換所述培養基以獲得 所述擴增的細胞； 其中，整個所述擴增中使用的所述培養基濃度范圍從約0. 15ml/cm2至約0. 35ml/cm2。15. 根據權利要求14所述的方法，其中，所述擴增使細胞數目增加了至少40倍。16. 根據權利要求1所述的方法，其中，通過使所述細胞與所述培養基接觸的所述擴增 包括以下動作： a. 通過以范圍從約1000個細胞/cm2至約7000個細胞/cm2的接種密度接種所述細胞 并且將所述培養基提供給所述接種的細胞，將所述培養的細胞擴增成連續傳代； b. 允許所述細胞達到約40%至約50%的預定匯合，并且更換所述細胞的所述培養基； c. 通過以范圍從約1000個細胞/cm2至約7000個細胞/cm2的接種密度接種所述細胞 并且將所述培養基提供給所述接種的細胞，進一步將步驟b的所述細胞擴增成第二連續傳 代； d. 允許所述細胞達到約30 %至約40 %的預定匯合，并且在并不除去所述消耗培養基 的情況下，將所述培養基添加至所述細胞；以及 e. 允許所述細胞達到約60 %至約70 %的第二預定匯合，并且更換所述培養基以獲得 所述擴增的細胞； 其中，整個所述擴增中使用的所述培養基濃度范圍從約0. 15ml/cm2至約0. 35ml/cm2。17. 根據權利要求16所述的方法，其中，所述擴增使細胞數目增加了至少2000倍。18. 根據權利要求1所述的方法，其中，以范圍從每ml冷凍混合物約5百萬個細胞至約 0. 25億個細胞的細胞密度，用冷凍混合物將在所述培養之后獲得的所述細胞進行冷凍。19. 根據權利要求18所述的方法，其中，所述冷凍在范圍從約-75攝氏度至約-85攝氏 度的溫度下，或在范圍從約-190攝氏度至約-200攝氏度的溫度下進行；并且其中，所述冷 凍混合物包括濃度范圍從約2%至約15%，優選地，約5%的冷凍保存劑；并且其中，所述冷 凍保存劑優選是DMSO。20. 根據權利要求19所述的方法，其中，所述細胞密度下的所述冷凍允許保留活力和 解凍后的功能。21. 根據權利要求1所述的方法，其中，所述方法包括以下動作： a.在包括堿性成纖維細胞生長因子，S卩bFGF的培養基存在下，允許培養直至傳代3次 的所述間質基質細胞擴增至傳代5次； 其中，當所述細胞實現至少一個預定匯合時，通過使所述細胞與所述培養基接觸進行 所述擴增；并且其中，當與所述傳代3次的所述細胞數目相比時，所述方法使傳代5次結束 時的所述細胞的數目增加了至少2000倍。22. 根據權利要求21所述的方法，其中，所述至少一個預定匯合選自包括約30%至約 40%、約40%至約50%、以及約60%至約70%、或它們的任何組合的匯合范圍。23. 根據權利要求1所述的方法，其中，通過使所述細胞與所述培養基接觸的所述擴增 包括以下動作： a. 通過以范圍從約1000個細胞/cm2至約7000個細胞/cm2的接種密度接種所述傳代 3次的細胞并且將所述培養基提供給所述接種的細胞，將所述培養至傳代3次的細胞擴增 成傳代4次； b. 允許所述細胞達到約40%至約50%的預定匯合，并且更換所述培養基； c. 通過以范圍從約1000個細胞/cm2至約7000個細胞/cm2的接種密度接種所述細胞 并且將所述培養基提供給所述接種的細胞，進一步將在步驟b結束時獲得的所述細胞擴增 成傳代5次； d. 允許所述細胞達到約30 %至約40 %的預定匯合，并且在并不除去所述消耗培養基 的情況下添加所述培養基；以及 e. 允許所述細胞達到約60 %至約70 %的第二預定匯合，并且更換所述培養基以獲得 所述擴增的細胞； 其中，整個所述擴增中使用的所述培養基濃度范圍從約0. 15ml/cm2至約0. 35ml/cm2。24. 根據權利要求1所述的方法，其中，在配制成用于臨床或治療應用的預定劑型之前 將在所述培養過程之后獲得的細胞進一步進行離心和洗滌過程的組合；并且其中，對于所 述預定劑量，所述組合將存在的牛血清白蛋白，即BSA的水平減少至低于50ng/ml的量，其 中，在通過所述培養基中的所述FBS的培養過程期間，將所述BSA提供給所述細胞。25. -種對于配制用于臨床或治療應用的劑量將BSA的量減少至低于50ng/ml水平的 方法，所述劑量包括通過培養所述細胞獲得的間質基質細胞，所述方法包括以下動作：將所 述組合物進行離心和用磷酸鹽緩沖鹽水洗滌的組合以減少所述BSA的量。26. 根據權利要求25所述的方法，其中，在涉及使用牛源組分的培養所述細胞的過程 中，將高于50ng/ml量的所述BSA提供給所述細胞；并且其中，低于50ng/ml的水平不考慮 在所述劑量中所述細胞數目。27. 根據權利要求25所述的方法，其中，所述方法包括以下動作： a. 將所述細胞以范圍從約1200rpm至約1800rpm的速度進行第一次離心持續范圍從約 7分鐘至約10分鐘的時間段； b. 對于約60萬至約6百萬的范圍內的細胞數目，將所述離心的細胞用約20ml的DPBS 進行第一次洗滌，并且在范圍從約1200rpm至約1800rpm的速度下再次離心所述洗滌的細 胞持續約10分鐘的時間段； c. 對于約600至約6百萬的范圍內的細胞數目，將所述再次離心的細胞用約7ml至約 9ml的DPBS進行第二次洗滌，隨后可選地合并所述細胞樣品；以及 d. 在范圍從約1200rpm至約1800rpm的速度下，再次離心來自步驟c的所述洗滌的細 胞持續范圍從約5分鐘至約7分鐘的時間段以獲得具有低于50ng/ml的水平的BSA的所述 細胞。28. -種用于儲存間質基質細胞的方法，所述方法包括以下步驟：在范圍從每ml的所 述冷凍混合物約5百萬個細胞至約0. 25億個細胞的細胞密度下，使所述細胞經受冷凍混 合物，以及在范圍從約-75攝氏度至約-85攝氏度的溫度下或在范圍從約-190攝氏度至 約-200攝氏度的溫度下儲存所述細胞。29. 根據權利要求28所述的方法，其中，在范圍從每ml的所述冷凍混合物約5百萬個 細胞至約〇. 25億個細胞的細胞密度下并且在范圍從約-75攝氏度至約-85攝氏度的溫度 下，將所述間質基質細胞儲存在冷凍混合物中允許在不存在液氮的情況下保留活力和解凍 后的功能持續至少1周的時間段。30. 根據權利要求28所述的方法，其中，在范圍從每ml的所述冷凍混合物約5百萬個 細胞至約〇. 25億個細胞的細胞密度下并且在范圍從約-190攝氏度至約-200攝氏度的溫 度下，將所述間質基質細胞儲存在冷凍混合物中允許保留活力和解凍后的功能持續至少1 個月的時間段。31. 根據權利要求28所述的方法，其中，所述冷凍混合物包括濃度范圍從約4%至約 11 %，優選地，約5%的冷凍保存劑；并且其中，所述冷凍保存劑優選為DMSO。32. 根據權利要求28所述的方法，其中，在所述細胞密度下的所述冷凍允許保留活力 和解凍后的功能。33. 根據權利要求28所述的方法，其中，通過根據權利要求1所述的方法通過培養所述 細胞獲得所述間質基質細胞。34. 根據權利要求28所述的方法，其中，在為了治療目的給予需要其的受試者之前，所 述方法消除了所述細胞的重新構成。
【專利摘要】本發明公開了擴大間質基質細胞生產的方法、組合物及其試劑盒。本發明公開了用于臨床級間質基質細胞(MSC)的一致生產的穩健制造方法。所述方法能夠生產高活力的潛能細胞。微調與培養基的制備、細胞接種、細胞收獲有關的過程步驟，以實現細胞產率的一致性、優良的細胞活力、純度、改善的細胞增殖、較高的細胞恢復、較低的HLA-DR表達、培養持續時間減少。在不存在細胞損失/細胞應激的情況下，通過優化洗滌方法進一步改善了細胞的活力和純度。本發明進一步提供了在高細胞密度下冷凍儲存MSC而不影響細胞活力的方法。本發明進一步提供了在-80℃下儲存和運輸的經濟手段。
【IPC分類】A01N1/02, C12N5/077, A61K35/35
【公開號】CN105274051
【申請號】CN201510095622
【發明人】烏代庫馬爾·科昆德卡爾, 斯瓦蒂·孫達爾·拉杰, 蘇達·巴拉蘇布拉馬尼安, 查蘭·泰伊, 阿什溫·庫尼賈爾·姆魯特云賈亞, 德維·達莫達蘭, 巴拉穆魯甘·拉馬達塞, 斯瓦魯普·巴格瓦特, 阿尼什·森·馬宗達
【申請人】斯蒂姆普優提克斯個人研究有限公司
【公開日】2016年1月27日
【申請日】2015年3月3日
【公告號】CA2878299A1, EP2960329A1