在不必重新構成/稀釋細胞組合物的情 況下，制造給予患者的實驗室到臨床產品。
[0194] V.最終產品即可用在實驗室，如同藥用產品。
[0195] 通過以下實施例和附圖進一步闡述了本公開內容。然而，這些實施例不應解釋為 限制本公開的范圍。
[0196] 實施例1 :
[0197] 骨髓衍牛的MSC的分離和細朐培養最高汰傳代3次（P3)：
[0198] 在獲得知情同意之后，在一般手術室中，在全身麻醉下使用肝素化注射器從髂嵴 的后上方吸取來自20-40歲年齡范圍內的健康志愿者的約60-70ml骨髓，并且收集在單獨 的血袋中。20ml注射器用于通過細胞濾網（cellstrainer) (100μπι)轉移樣品以除去骨 針、血塊和細胞團塊并且收集在離心管中。在取骨髓之前，針對作為強制篩選測試的人類免 疫缺陷病毒（HIV1)、乙型肝炎（HBV)、丙型肝炎（HCV)以及巨細胞病毒（CMV)，篩選志愿者。
[0199]在目前良好制造規范（cGMP)中進行骨髓處理和隨后的培養。簡要地，將骨髓用包 括Dulbecco改良的Eagle培養基knock-out(DMEM-KO) (80% )、胎牛血清（10% )、1Mmol的谷氨酰胺和50U/ml至lOOU/ml的青霉素以及50μg/ml至100μg/ml的鏈霉素的完全 培養基稀釋（1:1)，并且在約1200rpm至約1800rpm下離心約10分鐘至約20分鐘以除去 抗凝劑。用于以上稀釋的完全培養基缺乏bFGF。除去上清液并且再次用不具有bFGF的完 全培養基稀釋骨髓。使用50ml離心管（Falcon，BectonDickinson)中的Lymphoprep，通過 密度梯度方法分離骨髓衍生的單核細胞（MNC)。該方法包括取另一離心管Lymphoprep[密 度梯度溶液]、添加雙倍體積的稀釋的骨髓并且在室溫下在約1200rpm至ISOOrpm下離心 約10分鐘至20分鐘，其中，室溫是20°C至25°C。分離積聚在棕黃層界面上的骨髓MNC并 且用缺乏bFGF的完全培養基再次洗滌。將分離的傳代0次（P0)的單核細胞鋪板在T-75 培養瓶（?&1(3〇11，136(31:〇110;^1<1118〇11)中，并且在補充有10%的胎牛血清（辦(]1〇116)、2001]1]\1 的glutamax(Gibco-Invitrogen)、50U/ml至 100U/ml的青霉素以及 50μg/ml至 100μg/ ml的鏈霉素的DMEM-KO中培養，并且在37°C和5%潮濕的0)2下溫育。在48h之后，除去未 粘附的細胞，并且進行培養基的第一次完全改變。隨后，每隔48h補充培養基。頻繁的培養 基更換主要確保MSC由于它們的獨特的塑料粘附特性而附著至表面。在約80% -85%的期 望匯合后，吸出完全培養基并且用Dulbecco磷酸鹽緩沖鹽水（DPBS)洗滌細胞兩次。每個 T-75燒瓶添加約l-2ml的胰蛋白酶并且在37°C下溫育約2分鐘至3分鐘。胰蛋白酶的作 用使用包括DMEMK0、10%的FBS和青鏈霉素（Pen-Str印）[50U/ml至100U/ml的青霉素和 50μg/ml至100μg/ml的鏈霉素]的中和培養基中和，并且收集中和的樣品并且在室溫下 在約1200rpm至1500rpm下離心約10分鐘至20分鐘。向球粒（pellet)中添加完全培養 基，隨后進行細胞計數。此后，使用包括約85%至95%的FBS和約5%至15%的DMS0的冷 凍培養基，以約1百萬/ml的濃度將MSC冷凍在小瓶中，這被稱作傳代0次（P0)細胞（即， 1-2小瓶）。在第7天或第8天（培養期間）改變完全培養基，將其余細胞以約6, 666個細 胞/cm2的接種密度在細胞堆疊（cellstack)中培養/擴增，并且在第14天至第18天之 間用0. 25%的胰蛋白酶/EDTA(Gibco-Invitrogen)收獲細胞。用包括DMEMK0、10%的FBS 和青鏈霉素[50U/ml至100U/ml的青霉素和50μg/ml至100μg/ml的鏈霉素]的中和培 養基中和胰蛋白酶化的細胞，并且收集在離心管中用于在約1200rpm至1500rpm下離心約 10分鐘至20分鐘。將球粒再懸浮在完全培養基中以評估細胞計數。在包括約85%至95% 的FBS和約5%至15%的DMS0的冷凍培養基中，以約1百萬個細胞/ml至3百萬個細胞/ ml的濃度將收獲的細胞冷凍在小瓶中，這被稱作傳代1次（P1)細胞。將來自傳代1次的 MSC在6, 666個細胞/cm2的接種密度下再鋪板在單個單細胞堆疊中，并且在補充有10%的 胎牛血清（HyClone)、200mΜ的glutamax(Gibco-Invitrogen)、50U/ml至 100U/ml的青霉 素以及50μg/ml至100μg/ml的鏈霉素的DMEM-KO中培養，并且在37°C和5%潮濕的C02 下溫育。簡要地，方法如下：在其中從一名以上供體吸取初始骨髓的情況下，取出各自具有 P1細胞的一個小瓶，計數并且可選地以每個供體相等的比例合并。在計數并且可選地合并 供體細胞之后，檢查細胞的活力；并且根據獲得的細胞計數將有活力的細胞鋪板在2-10個 室中。此后，將培養室轉移至約37°C下的5%的C02培養箱。在每隔48-72小時之后，在顯 微鏡下觀察細胞堆疊并且拍攝兩張代表性的顯微照片。用包括DMEM-KO、FBS、谷氨酰胺、青 鏈霉素和堿性成纖維細胞生長因子（bFGF)的新制備的完全培養基，每第7天至第8天補充 完全培養基。培養細胞直至室中的細胞約80% -85%匯合。
[0200] 一旦傳代1次培養物匯合，通過收獲匯合的培養物并且以1000個細胞/cm2的 接種密度進行接種將它們進一步擴增最高達傳代3次，并且在補充有10 %的胎牛血清 (HyClone)、200mM的glutamax(Gibco-Invitrogen)、50U/ml至 100U/ml的青霉素和 50μg/ ml至100μg/ml的鏈霉素以及另外添加2ng/ml的堿性成纖維細胞生長因子（bFGF)的生長 因子的DMEM-K0中培養，并且在37°C和5%的潮濕的C02下溫育。對于大規模生產，將P3的 MSC鋪板在一個 10-細胞堆疊（l〇-cellstack)(康寧生命科技，CorningLifeSciences) 上。簡要地，方法如下：當P1細胞達到約80%至85%匯合時，吸出完全培養基并且將細胞 堆疊用DPBS洗滌兩次。在添加洗滌胰蛋白酶，并且將細胞在約37°C下溫育約4分鐘至5分 鐘之后，此后，用中和培養基將它們中和。收集中和的樣品，并且在室溫下在約1200rpm至 ISOOrpm下離心約10分鐘至20分鐘。對于因此獲得的球粒，添加完全培養基并且進行細胞 計數。此后，為了另一次傳代，在細胞堆疊中培養/擴增細胞，收獲細胞并且離心。對于獲 得的球粒，添加完全培養基并且進行細胞計數。在約_196°C下冷凍小瓶，使得每個小瓶在包 括約85 %至95 %的FBS和約5 %至15 %的DMS0的冷凍混合物中包括約1-3百萬個MSC。 這形成傳代3次（P3)的細胞，并且此后，用于未來的大規模擴增。
[0201] 制備頂P組合物
[0202]用于制備頂P或傳代3次后的骨髓衍牛的基質細朐的最終組合物的方法
[0203] 用于制備頂P或骨髓衍生的MSC的最終組合物的方法通過首先培養細胞超過傳代 3次開始以獲得具有高質量和免疫特性的高產率MSC。在傳代3次之后，所述方法通過首先 制備bFGF母液混合物（mastermix)以及包括該母液混合物的培養基用于均勾分布所述 bFGF而不存在任何體積誤差開始。此后，所述方法包括制備種子母液混合物，隨后根據定 義的用于進一步擴增細胞的時間表接種細胞、培養和改變培養基。然后，洗滌擴增的培養物 以除去BSA，并且根據所需的臨床和/或治療應用，將細胞繼續用于制備最終組合物或頂P。 該方法進一步順序地定義如下。
[0204] 1.制備包括用于培養和處理傳代3次后的細朐的bFGF母液混合物的培養基:
[0205]bFGF母液混合物的制備避免了體積誤差并且提供了bFGF對于用于細胞培養/擴 增的完全細胞培養基的均勻分布。因此，當添加至細胞堆疊時，制備的完全細胞培養基確保 提供給細胞均勻濃度的bFGF。該方法（圖5A)改善了所有十層堆疊（stack)中的生長特 性一致性和細胞產率。因此，對于維持生產過程中的一致性、較高的細胞產率和細胞質量， bFGF母液混合物提供了顯著的貢獻。
[0206] 制備具有2ng/ml的bFGF的培養基:
[0207] 1.制備包括K〇-DMEM、FBS、Glutamax和青霉素/鏈霉素但缺乏bFGF的8L培養基， 并且分配到八個1L的無菌杯（Stericup)中并且從1至8標記。
[0208] 2.從培養基容器1號，吸取200ml培養基并且分配到標記為9號的無菌容器中。
[0209] 3.將1600ul的bFGF(即，16000ng的bFGF)添加至容器1號的800ml培養基，并 且充分地混合并且標記為bFGF母液混合物。
[0210] 4.從由2至8標記的每個容器取出100ml的培養基并且添加至容器9號的200ml 培養基，從而使得容器9號的總培養基體積成為900ml[來自容器1號的200ml+來自容器 2號至8號每一個的100ml]。
[0211] 5.取出100ml的bFGF母液混合物并且添加至各個900ml培養基（S卩，容器2號至 9號），并且所述容器每個的體積因此成為最高達1000ml。
[0212] 現在，從2至9標記的每個容器具有1L具有均勻分布的bFGF母液混合物的培養 基（包括2000ng的bFGF的1000ml培養基，S卩，2ng/ml的bFGF濃度）。該過程由圖5A表 不。
[0213] 2.制備用在培養和處理傳代3次后的細朐的種子母液混合物：
[0214] 種子母液混合物（seedmastermix)的制備避免體積誤差并且提供對于所有細胞 堆疊的均勻細胞分布。對于在所有TCS中的均勻增殖和細胞產率的一致性的方法，種子母 液混合物（圖5B)提供了顯著的貢獻。
[0215] 1.對于每個10CS，接種了 6. 36百萬個有活力的細胞。接種5-10CS所需的總細胞 是0. 318億個有活力的細胞和百萬個細胞/ml的細胞懸浮液。
[0216] 2.取包含2ng/ml的bFGF培養基的一個培養基容器，除去31. 8ml的培養基并且添 加31. 8ml的細胞懸浮液。從具有從3號標記至7號的bFGF培養基的各個容器移開200ml 的培養基，并且單獨地儲存在無菌容器10號中。
[0217] 3.收集200ml的種子母液混合物并且轉移至3號至7號容器的各800ml的培養 基。
[0218] 4.現在，每個容器具有存在細胞懸浮液的1000ml培養基。將1000ml的細胞懸浮 液接種至每一個10CS，并且分布至10CS的所有區室。
[0219] 5.最后，將另一個500ml培養基從容器8號至10號添加至每個10CS。每個10CS 的最終體積是1. 5L。
[0220] 該過程由圖5B表示。
[0221] 在大規模生產過程中使用bFGF和種子母液混合物，圖6A和6B提供了批次一致性 數據和降低的HLA-DR表達的細節。這些圖還示出了與不包括這種bFGF母液混合物和種子 母液混合物的先前已知方法的比較。
[0222] 3.細朐接種、培養和培養基改奪時間表：
[0223] 通過以1000個細胞/cm2的接種密度將細胞接種在一個細胞堆疊中，在培養的第1 天，用以上制備的150ml的培養基補充細胞，并且當實現40-50%的匯合時，用150ml的培養 基進一步補充細胞，將傳代3次的細胞擴增至傳代4次。該階段獲得的產率是約25-40X106 個細胞/1CS，并且該過程所需的總持續時間是約8-9天。
[0224] 4.講一步擴增細朐：
[0225] 進一步地，通過以1000個細胞/cm2的接種密度，將細胞接種在十個細胞堆疊中將 這些細胞擴增至傳代5次。在培養第一天，用1. 5L培養基補充這些細胞。在實現約30-40% 的匯合后，在沒有除去消耗培養基（spentmedium)(培養基注滿（mediatopup))的情況 下，將0. 5L培養基添加至每個細胞堆疊。當培養物達到約60-70%的匯合時，進行完全培養 基改變的步驟，其中，從所有TCS中完全除去消耗培養基并且將2L的培養基添加至每個細 胞堆疊。該階段獲得的產率是450-600X106個細胞/10CS，并且與先前已知方法的14天 相比，該過程所需的總持續時間是約09-10天。由于在每個細胞堆疊60萬至約70萬個細 胞的相同接種密度下，在傳代4次結束時獲得的所有細胞在范圍從約40至約70個細胞堆 疊的不同細胞堆疊中擴增，在傳代5次結束時獲得的細胞總數目范圍從約18億個細胞至約 42億個細胞。
[0226] 5.洗滌處理：
[0227] 然后，將這些細胞進行包括以下步驟的洗滌處理：
[0228] -在約1200rpm至約1800rpm下第一次離心細胞約7分鐘至約10分鐘。然后，用 約200ml的DPBS/10個細胞堆疊洗滌細胞，并且在約1200rpm至約1800rpm下再次離心約 10分鐘。
[0229] -在第二次洗滌中，每10個細胞堆疊添加約70ml至約90ml的洗滌緩沖液-DPBS， 隨后合并細胞樣品。
[0230] -在約1200rpm至約1800rpm下再次離心合并的細胞約5分鐘至約7分鐘。
[0231] 在用于傳代3次之后細胞擴增的完全細胞培養基（如提供在表2中的）中，FBS 用作是牛源的補充物，并且因此，在臨床應用之前，需要從產品中除去牛血清白蛋白（BSA)。 如以上指出的洗滌步驟降低了最終產品中的BSA水平（即，<50ng)，最終產品是在CS5中 主要包含骨髓衍生的異源MSC的組合物。同樣，細胞組合物可以與CS10結合使用，或與人 血清白蛋白、勃脈力A(PlasmalyteA)和二甲基亞砜（DMS0)結合使用。優選地，最終細胞 組合物包含在約lml至約8mlCS5中約0. 25億至約2億個間質基質細胞。細胞密度/ml的 最終組合物可以是0. 25億個細胞/ml的CS5、0. 5億個細胞/2ml的CS5、4ml的CS5中1億 個和/或8ml的CS5中2億個細胞。圖8A清楚地示出了按照以上公開的洗滌操作減少頂P 中的BSA。
[0232] 最終產品涕送和儲存：將閔此獲得的頂P冷凍保存在CrystalZenith小瓶（CZ小 瓶）中的配制培養基Cryostor5(CS5)中。還可以將其冷凍保存在袋小/瓶中以及冷凍 保存在用于細胞保存的任何其他冷凍保存培養基中。對于制備IMP的方法，該步驟不是強 制性的，但對于最終遞送是重要的。在該步驟中，細胞的高冷凍密度是每ml的冷凍混合物 5-25百萬個細胞，并且將MSC直接儲存在負（_)80°C下。儲存細胞的該方法對于較短的持 續時間是理想的，并且不包括在-196Γ下任何暴露于液氮。該方法確保細胞的優良的短期 儲存，包括解凍時的高細胞活力和細胞恢復（cellrecovery)。
[0233] 另一方面，如果IMP需要儲存較長的時期，如超過幾周或幾個月，優選地，超過1個 月，以每ml冷凍保存液約5百萬至約0. 25億個細胞的高細胞密度將獲得自本公開的培養 和洗滌過程的細胞冷凍保存在（_)196°C下。在解凍時，高冷凍密度和在負（_)196°C下儲存 的組合不會影響細胞活力和細胞恢復。
[0234] 以上操作主要涉及作為即可使用的病床邊產品最終遞送至市場。細胞類產品中的 主要挑戰是以在不存在任何進一步的處理的情況下可以使用的方式遞送細胞類產品。根據 常規操作，解凍儲存在液氮中的細胞產品并且在給予患者之前進行重新構成。該過程需要 潔凈室設備和對于最終市場遞送具有挑戰的技術人員。使用液氮進行細胞產品的儲存和 運輸是昂貴的方法，并且因此，在負（-)80°C下儲存和運輸細胞組合物的本操作具有成本效 益。
[0235] 因此，本公開提供了用于配制、儲存和運輸細胞組合物的過程，其中，將高數目的 細胞冷凍在較小體積的冷凍保存液中，其中，以5-25百萬/mlCryoStor5的細胞密度冷凍 保存細胞，并且針對較短持續時間需求，將這些細胞直接保存在（_) 80°C下。
[0236] 在CS5中高冷凍密度和在負（_)80°C下儲存的組合不會降低細胞活力和恢復。根 據冷凍或儲存所需的持續時間，在-80°C或_196°C下在0. 25億個細胞/ml的CryoStor5 的冷凍混