擴大間質基質細胞生產的方法、組合物及其試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本公開涉及處理間質基質細胞以獲得有活力和有潛能的干細胞組合物的方法。特 別地，本公開涉及用于獲得高細胞產率的一致性、增加的活力、低HLA-DR和潛能的用于臨 床和治療應用的間質基質細胞的方法。進一步地，本公開還涉及首尾相接（end-to-end)的 生產方法以及在針對所述應用給藥之前或過程中減少最終組合物的操作。
【背景技術】
[0002] 人類間質基質細胞（hMSC)作為較小群體的細胞存在于骨髓中（占0.001 %至 〇. 01%的有核細胞），但在培養中它們可以快速生長并且擴增而不損失它們的干細胞特性 (sternness)。具有它們的以下屬性的hMSC具有在許多受損組織中增強修復的潛能：（1)容 易分離、（2)高擴增潛能、（3)遺傳穩定性、（4)可重復特性以及（5)與組織工程原理的相容 性。
[0003] 現在，MSC和MSC類細胞已經從除了骨髓包括脂肪組織、羊水、骨膜（periostium) 和胎兒組織的各種組織中分離，并且示出了表型異質性。已經廣泛研究了獲得自人類來源 如骨髓（hBMSC)的間質基質細胞，這是因為它們的相對容易獲得以及分化成骨形成、脂形 成和軟骨形成譜系，以及其他種類的組織或細胞（包括肝細胞、心肌細胞和神經元）的分化 潛能。它們的多種分化潛能和自我更新已經增加了對于該干細胞作為具有在再生醫學應用 中的自我更新的細胞來源的關注。此外，它們基于對于培養基質粘附的分離構成用于消除 非間質譜系的簡單策略，降低對于依賴特定表面標記物的表達的復雜的細胞分離方法的依 賴性。
[0004] 進一步地，通常使用平面技術（燒瓶）生產用于治療應用的粘附的間質干細胞。十 層堆疊（stack)或容器已經用于促進幾種異源細胞治療產品進入早期、中期至后期臨床開 發。擴大來自實驗室規模的基于傳統燒瓶的培養過程通常涉及商業可獲得的堆疊-板系統 如科寧細胞堆疊（CorningCellSTACKS)。這些多層容器已經用于大規模細胞培養。傳統 的10層細胞堆疊已經用于制造加工并且正在用作用于治療應用的異源間質基質細胞的良 好生產規范（GMP)生產的平臺。
[0005] 盡管，使用間質基質/干細胞的細胞治療示出了巨大希望，骨髓衍生的MSC的限制 是它們的較小數量，然而對于臨床應用，需要大量的MSC。隨著間質基質細胞（MSC)的研究 轉換為商業產品，將細胞類產品帶入市場的另一個主要阻礙是對于穩健并且可重復的生產 過程以及用于生物系統的冷凍保存介質和儲存容器的質量的需要。
[0006] MSC是多潛能的并且能夠分化成成骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞。已經更廣泛地使 用BM衍生的MSC并且存在更大量的與它們的臨床安全性和實踐有關的數據。為了滿足臨 床需求，需要快速并且穩健的MSC擴增方法用于均勻、現成產品的制造和大規模庫存的儲 存。在現有技術中，PCT申請號PCT/US2009/053891公開了包含具有降低的免疫原性的間質 干細胞的藥用組合物以及使用離心過濾制造其的方法。該專利申請是關于利用離心過濾制 造一種或多種純化的MSC藥用組合物的方法，但沒有公開細胞類產品的關鍵質量參數如細 胞產率和HLA-DR。進一步地，純化的MSC組合物包含小于55ug/ml的殘留BSA。然而，這沒 有提供實現細胞產率、活力和質量參數如低HLA-DR和純度的增加的見解。美國專利申請號 13/267, 363提供了具有重要治療潛能、具有培養中穩定的結構和功能表型的間質干細胞的 制備，擴增MSC以生產臨床規模的治療制劑的方法及其醫療用途。另一個PCT申請號PCT/ US2011/022054集中于用于制造細胞治療產品以及使用TFF(該技術用于降低隨后過程中 的BSA含量），通過體積減小洗滌細胞治療產品的方法和裝置。然而，在TFF過程中，沒有提 供關于細胞損失的數據，并且此外，BSA水平在約100ng/ml的范圍內，這被認為不適合用于 治療應用。因此，對于將確保生長因子（bFGF)對于用于均勻細胞分布和增殖的培養基的均 勻分布的方法，用于改善細胞產率、活力、一致性、減少的培養持續時間和細胞損失、沒有雜 質的方法以及保存細胞產品以改善其保質期的方法，仍然存在需要。
[0007] 傳統遵循的干細胞擴增和細胞類產品的最終遞送的方法中看出的主要阻礙是：
[0008] ?缺乏短持續時間內獲得較大細胞產率的一致生產；
[0009] ?洗滌和離心過程期間的高細胞損失，導致低細胞產率和活力；
[0010] ?昂貴的儲存和運輸；
[0011] ?在給予患者之前，要求一定量的冷凍保存的細胞的重新構成（復原， reconstitution);以及
[0012] ?在醫院進一步操作冷凍保存的細胞，由此使得產品易受細胞損失或無菌度損失。
[0013] 因此，本公開提供了用于克服以上問題的方法和裝置。因此，本公開嘗試克服對于 綜合生產過程以及最終產品的儲存的開發的增加需要。因此，致力于方法改善和用于開發 即可使用的用于細胞治療的異源間質基質/干細胞的策略，當今，異源間質基質/干細胞是 細胞治療中最廣泛使用的細胞類型。
【發明內容】
[0014] 本公開涉及用于培養間質基質細胞的方法，所述方法包括以下動作：在包括堿性 成纖維細胞生長因子（bFGF)的培養基存在下，允許培養直至第一預定傳代的間質基質細 胞擴增至第二預定傳代，其中，當所述細胞實現至少一個預定匯合時，通過使細胞與所述培 養基接觸進行所述擴增；并且其中，當與第一預定傳代的細胞數目相比時，所述方法使第二 預定傳代結束時的細胞數目增加了 2000倍。
[0015] 本公開還涉及對于配制用于臨床或治療應用的預定劑量將BSA的量減少至低于 50ng/ml的水平的方法，所述劑量包括通過培養所述細胞獲得的間質基質細胞，所述方法包 括將組合物進行離心和用磷酸鹽緩沖鹽水洗滌的組合以減少所述BSA的量的動作。
[0016] 本公開還涉及用于儲存間質基質細胞的方法，所述方法包括以下步驟：在范圍從 每ml的冷凍混合物約5百萬個細胞至約0. 25億個細胞的細胞密度下，使細胞經受冷凍混 合物，以及在范圍從約-75°C至約_85°C的溫度下或在范圍從約_190°C至約_200°C的溫度 下儲存細胞。
【附圖說明】
[0017] 為了可以容易地理解本公開并且付諸實踐，現在將參考如參照附圖示出的示例性 實施方式。根據本公開，附圖連同以下詳細描述并入說明書中并且形成說明書的一部分，并 且用于進一步示出實施方式并且說明各種原理和優點，其中：
[0018] 圖1中的A:示出了傳代4次（P4)每批次的間質基質細胞產率。
[0019] 圖1中的B:示出了來自圖1中的A的5個單獨批次的平均細胞產率。
[0020] 圖2 :示出了P5下來自不同批次的總細胞產率。
[0021] 圖3A:示出了來自本公開的不同批次的P5收獲的7AAD的活力百分數的圖形表 不。
[0022] 圖3B:示出了本公開的解凍后頂P的7AAD的活力百分數的圖形表示，顯示解凍后 的活力的顯著的一致性。
[0023] 圖3C:示出了圖3B的5個單獨生產批次的解凍后頂P的7AAD的活力百分數的平 均值。
[0024] 圖4A:示出了本方法的不同生產批次中收獲后HLA-DR表達的表示，其示出了 HLA-DR的顯著較低的表達。
[0025] 圖4B:示出了圖4A的5個單獨生產批次的收獲后HLA-DR表達的平均值。
[0026] 圖4C:示出了使用本公開的方法的不同生產批次中的解凍后HLA-DR表達的表示。
[0027] 圖4D:示出了圖4C的5個單獨生產批次的解凍后HLA-DR表達的平均值。
[0028] 圖5A:示出了bFGF母液混合物（mastermix)的制備。
[0029] 圖5B:示出了種子母液混合物（seedmastermix)的制備。
[0030] 圖6A:示出了實施bFGF和種子母液混合物之前（'先前已知的'）和之后（本公 開的'新方法'）在不同生產批次中細胞產率的一致性。
[0031] 圖6B:示出了實施bFGF和種子母液混合物之前（'先前已知的'）和之后（本公 開的'新方法'）在不同生產批次中HLA-DR表達的一致性。
[0032] 圖7A⑴和圖7A(2):示出了與其中根據天數進行培養的之前已知的方法（1) 相比，基于匯合的進料時間表對基于匯合的本方法的不同批次的單獨10細胞堆疊（Cell STACK)的細胞產率的影響（2)。
[0033] 圖7B⑴和圖7B⑵：示出了與其中根據天數進行培養的之前已知的方法⑴相 比，基于匯合的本方法的不同生產批次的單獨10細胞堆疊中HLA-DR表達（2)。
[0034] 圖8A:示出了按照本公開中指出的洗滌步驟（即，用200ml的DPBS進行洗滌I并 且用90ml的DPBS進行洗滌ΙΙΠΜΡ中的BSA水平相對于按照先前已知的洗滌步驟（即，各 自用200ml的DPBS進行洗滌I和洗滌II)獲得的頂P中的BSA水平的比較。
[0035] 圖8B:示出了如按照本公開中指出的洗滌步驟（即，用200ml的DPBS進行洗滌I 并且用90ml的DPBS進行洗滌II)獲得的本公開的最終產品中的細胞損失相對于按照先前 已知的洗滌步驟（即，各自用200ml的DPBS進行洗滌I和洗滌II)獲得的最終產品的細胞 產率的比較。
[0036] 圖8C:示出了當與先前已知的洗滌方法比較時，洗滌和離心對于來自本方法的最 終產品的解凍后的細胞恢復的影響。
[0037] 圖9A:示出了遵循用CS5冷凍保存的BM-MSC的7AAD的解凍后的活力，在每mlCS5 存在5百萬個細胞、0. 1億個細胞、0. 125億個細胞、0. 15億個細胞和0. 25億個細胞的五個 不同的冷凍濃度下，在一周、一個月、兩個月、三個月和六個月的冷凍保存期（時間點）下， 評價細胞活力。
[0038] 圖9B:示出了遵循用CS5冷凍保存的BM-MSC的解凍后的總細胞恢復（Totalcell recovery) (TCR)。在一周、一個月、兩個月、三個月和六個月的冷凍保存期（時間點）下，通 過用錐蟲藍染色細胞評價TCR。全部活力和無活力的總和計為TCR。觀察到了每mlCS5存 在5百萬個細胞、0. 1億個細胞、0. 125億個細胞、0. 15億個細胞和0. 25億個細胞的五個不 同的冷凍濃度的TCR。
[0039] 圖10A:示出了 25M劑量、50M劑量和75M劑量的不同劑量的每mlCS5冷凍混合物 25M細胞的7AAD在-196°C下儲存6個月的活力。
[0040] 圖10B:示出了 25M劑量、50M劑量和75M劑量的不同劑量的每mlCS5冷凍混合物 25M細胞在-196 °C下儲存6個月的細胞恢復。
[0041] 圖10C:示出了 1億和2億的不同劑量的每mlCS5冷凍混合物25M細胞的7AAD 在-196°C下儲存12個月的活力。Y軸表示7AAD的活力％。
[0042] 圖11A:通過抑制混合淋巴細胞反應（MLR)的能力示出了頂P的免疫抑制性能。數 據是六個單獨批次的平均值。
[0043] 圖11B:示出了來自頂P-MLR共培養物的上清液中的PGE-2的評價。數據是五個 單獨批次的平均值。
[0044] 圖11C:示出了生產的PGE-2的量和頂P的免疫抑制能力之間的相互關系。
[0045] 圖12 :示出了當與通過先前已知的方法生產的細胞類產品相比時，在生產VEGF方 面頂P的血管生成潛能。
[0046] 圖13 :示出了當與通過先前已知的方法生產的細胞類產品相比時，在生產sGAG方 面IMP的軟骨細胞潛能。
[0047] 圖14A:示出了直接穩定性和加速穩定性研究的第3個月時間點的7AAD的解凍后 活力。
[0048] 圖14B:示出了 -80°C直接（右邊）和加速穩定性（左邊）研究3個月的解凍后增 殖。
[0049] 圖14C:示出了 -80°C直接和加速（對照）穩定性研究的解凍后CFU-F。
[0050] 圖14D:示出了 -80°C直接和加速穩定性研究的三譜系分化。
【具體實施方式】
[0051] 本公開涉及用于培養間質基質細胞（mesenchymalstromalcell)的方法，所述方 法包括以下動作：
[0052]a.在包括堿性成纖維細胞生長因子（bFGF)的培養基的存在下，允許培養直至第 一預定傳代的間質基質細胞擴增至第二預定傳代；
[0053] 其中，當所述細胞實現至少一個預定匯合時，通過使細胞與所述培養基接觸進行 所述擴增；并且其中，當與所述第一預定傳代的細胞數目相比時，所述方法使第二預定傳代 結束時的細胞數目增加了 2000倍。
[0054] 在本公開的一個實施方式中，細胞數目的增加發生在21天的最大期間中。
[0055] 在本公開的另一個實施方式中，通過連續傳代，允許第一預定傳代的細胞擴增至 第二預定傳代；并且其中，第一預定傳代范圍從傳代2次至傳代9次；并且，第二預定傳代 范圍從傳代5次至傳代10次。
[0056] 在本公開的另一個實施方式中，第一預定傳代是傳代3次；并且，第二預定傳代是 傳代5次。
[0057] 在本公開的另一個實施方式中，用于所述擴增的接種的細胞的數目范圍從約60 萬至約70萬個細胞；并且，在所述擴增之后獲得的細胞的數目是至少約18億個細胞；并且 其中，所述方法使細胞數目增加了至少2000倍。
[0058] 在本公開的另一個實施方式中，培養基的組分是濃度范圍從約75 %至95%的 Dulbecco改良的Eagle培養基-KnockOut[DMEM-K0]、濃度范圍從約5 %至15 %的胎牛血清 [卩85]、濃度范圍從約0.5%至2%的谷氨酰胺、具有約501]/1111至約1001]/1111的濃度的青霉 素和約50μg/ml至約100μg/ml的濃度的鏈霉素的青鏈霉素、以及濃度范圍從約0. 5ng/ml 至5ng/ml的堿性成纖維細胞生長因子（bFGF)。
[0059] 在本公開的另一個實施方式中，以避免體積誤差并且提供bFGF在培養基的多個 等分部分中均勻分布的方式，通過母液混合組分的方法制備培養基，所述方法包括以下動 作：
[0060] a.制備'X'升包括DMEM-K0、FBS、谷氨酰胺和青鏈霉素，缺乏bFGF的培養基，以及 分配在'X'個lLtr容器中并且將容器從1至'X'標記；
[0061] b.從容器1號取出'Z'ml的培養基，并且分配在標記號為'Χ+Γ的新無菌容器 中；
[0062] c.將預定量的bFGF添加至'X減㈠Z'ml的容器1號的培養基，并且充分地混合 以獲得bFGF母液混合物；
[0063] d.從標記為2至'X'的容器的每個中單獨取出等量的培養基，并且在容器'Χ+Γ 號中添加'Z'ml的培養基，從而使得容器'Χ+Γ號的總培養基體積為'B'ml;以及
[0064] e.單獨取出第二預定量的在步驟（c)中獲得的bFGF母液混合物，并且在容器2至 'X'中各自添加'B'ml培養基，從而使得每個所述容器中的體積相等，并且制備培養基的多 個等分部分。
[0065] 在本公開的另一個實施方式中，至少一個預定匯合選自包括約30%至約40%、約 40 %至約50%、以及約60 %至約70%、或它們的任何組合的匯合范圍。
[0066] 在本公開的另一個實施方式中，通過使細胞與培養基接觸的擴增包括以下動作：
[0067] a.通過以范圍從約1000個細胞/cm2至約7000個細胞/cm2的接種密度接種細胞 并且將培養基提供給接種的細胞，將培養的細胞擴增成連續傳代；以及
[0068] b.允許細胞達到約40%至約50%的預定匯合，并且更換培養基以獲得擴增的細 胞；
[0069] 其中，整個擴增中使用的培養基濃度范圍從約0. 15ml/cm2至約0. 35ml/cm2。
[0070] 在本公開的另一個實施方式中，擴增使細胞數目增加了至少30倍。
[0071] 在本公開的另一個實施方式中，通過使細胞與培養基接觸的擴增包括以下動作：
[0072] a.通過以范圍從約1000個細胞/cm2至約7000個細胞/cm2的接種密度接種細胞 并且將培養基提供給接種的細胞，將培養的細胞擴增成連續傳代；
[0073] b.