合物的冷凍濃度下MP包括0. 25億個細胞至2億個細胞并且儲存在5ml至10ml填充尺寸的CZ小瓶中。
[0237] 實施例2：
[0238] 基于培養物：T合的大規樽擴增中的講料周期-灃滿（t〇D-UD)和完全培養基改奪 的重要件：
[0239] 培養基進料在大規模擴增中起重要作用，因為30%至40%匯合下的培養基注滿 (mediumtopup)改善了MSC的增殖。進一步地，在60%至70%匯合下完全培養基改變 (CMC)增強了增殖而沒有損害大規模培養物的活力和質量。進一步地，CMC改善了細胞產率 一致性并且減少了培養持續時間。
[0240] 改善的優點
[0241] i)相對于活力、細胞數目和HLA-DR，所有十個細胞堆疊中批次間一致
[0242] ii)細胞產率增加
[0243] iii)HLA-DR的低表達
[0244] HLA-DR表達中的一致性：
[0245] 因此，如在表明不同生產批次中總細胞產率和HLA-DR表達的圖7A(1)和圖7A(2) 以及圖7B(1)和圖7B(2)中示出的，本公開的方法示出了包括基于匯合的培養基改變，示出 了當與根據天數培養基改變的先前已知方法相比時，顯著更好的結果。
[0246] 實施例3：
[0247] 在MSC的大規樽擴增中本公開的洗滌步驟的重要件:
[0248] 除去雜質/顆粒的洗滌操作非常關鍵，并且對于一致性地實現所需細胞質量，洗 滌步驟過程的微調非常必要，并且甚至輕微的變化也可以產生不同的結果。因此，針對洗滌 和離心的制造過程的優化最小化了細胞損失，同時降低了BSA水平并且一致性地改善了最 終產物的解凍后的活力。許多細胞治療靜脈給藥，其中，將微粒或完整的微載體攜帶到最終 產品中造成嚴重的安全風險。針對處理大規模培養物的廣泛的優化和驗證，確保所有的微 粒從細胞懸浮液中除去增加了系統的有效產率。用DPBS的順序洗滌步驟和離心可以促進 細胞分離并且幫助去除微粒材料。
[0249] 本公開的洗滌過程的優點
[0250] i.洗滌步驟改善了頂P的純度。
[0251] ii.減少的細胞損失
[0252] iii.洗潘步驟提尚了最終廣品的活力和質量。
[0253]在按照包括用200ml的DPBS進行第一次洗滌并且在1800rpm下離心10分鐘[洗 滌-I]，隨后用200ml的DPBS進行第二次洗滌并且在1800rpm下離心10分鐘[洗滌-II] 的洗滌操作的先前已知方法中，最小化最終產品中的BSA水平。這與用在本公開的目前方 法中的包括以下的洗滌操作相比較：用200ml的DPBS進行第一次洗滌，在1800rpm下離心 10分鐘[洗滌-I]，隨后用90ml的DPBS進行第二次洗滌，在1800rpm下離心7分鐘[洗 滌-II]。可以觀察到，在遵循本公開的新洗滌操作后，存在細胞損失減少（圖8B)并且通過 BSA水平的顯著降低改善了最終產品的活力（圖8A)[如通過牛白蛋白ELISA試劑盒（BSA) 試劑盒目錄號：8100評估的；由AlphaDiagnostics制備的]。進一步地，所述洗滌[洗 滌-II]步驟最小化了細胞損失并且提高了最終產品的解凍后的活力/細胞恢復（圖8B和 8C)。在先前已知的方法中，細胞損失高、活力低，因此影響細胞質量。本改進的/改善的洗 滌操作能夠減少細胞損失并且在所述操作中不會影響細胞活力，并且提高了細胞質量。
[0254] 實施例4：
[0255] 高冷凍密度減小了臨床試驗點的橾作:
[0256] 本公開目的在于使用增強優良的細胞活力和解凍后的多潛能性功能的完全無異 物、無血清的冷凍培養基，開發高冷凍密度。在具有較高的解凍后活力的情況下，應當允許 以冷凍狀態存儲細胞治療產品（在-196°C下儲存多年）。審慎評估MSC的不同冷凍濃度， 并且對于用于儲存和遞送的最終細胞治療產品的冷凍濃度，發現25M個細胞/mlCryoStor 5的濃度是理想的。
[0257] 7AAD活力和細胞恢復：
[0258] 在每ml的冷凍保存培養基CryoStor5存在5百萬個細胞、0. 1億個細胞、0. 125 億個細胞、〇. 15億個細胞以及0. 25億個細胞的不同濃度下，使用CryoStor5冷凍BM-MSC。 在0周、1周、2周、4周、12周以及24周的不同時間點，分析解凍后的細胞恢復和活力。在 所有時間點，活力和細胞恢復（圖9A和9B)顯示為>98%。
[0259] 進一步地，通過在25M個細胞/ml下將頂P冷凍在5ml的CZ小瓶的CryoStor5 中并且在-196Γ下儲存最高達12個月的不同的時間點，分析了 25M(百萬）、50M(百萬）和 75M(百萬）產品的不同劑量的穩定性。
[0260] 在最高達12個月的所有時間點過程中，以25M個細胞/ml冷凍的25M個細胞、50M 個細胞和751個細胞的所有劑量已經示出>85%的活力和細胞恢復（圖1(^和1(?)。圖1(^ 示出了對于1億和2億的不同劑量的每mlCS5冷凍混合物25M個細胞的7AAD在-196°C下 儲存12個月的活力。
[0261] 使用本公開的目前的方法如此制備的細胞是低免疫原性的（hypoimmunogeneic) 和免疫調節的。在以下實施例中進一步分析了細胞的這些特性。
[0262] 實施例5：
[0263] 頂P的低免痔原件特件、免痔調節特件和血管牛成特件:
[0264] 由本方法開發的IMP的MSC表現出低免疫原性特性（hypoimmunogenic)、免疫調節 特性和血管生成特性。
[0265]評估IMP的免疫原性和免疫抑制能力：
[0266] 由于它們重要的免疫調節特性，間質基質細胞（MSC)具有用作跨越主要組織相容 性復合體（MHC/HLA)屏障的現成的治療劑的潛能。它們抑制有絲分裂原（mitogen)活化的 或同種異型活化的淋巴細胞的增殖。因此，在刺激異源受體中的T細胞應答下，MSC效率低， 并且當跨越人類的HLA屏障移植時，MSC具有很好的耐受性。MSC的免疫抑制機理是主要通 過分泌免疫調節細胞因子。前列腺素-E2(PGE-2)是MSC介導的免疫抑制的重要調節物之 〇
[0267] 由最終產品產生的PGE-2的評估免疫抑制能力和量以確定頂P的免疫潛能。
[0268] 通過以下方法確定頂P的免疫抑制能力：
[0269] 確定獲得自本公開的方法的頂P細胞的免疫抑制特性，測試它們抑制混合淋巴細 胞反應（MLR)的能力。使用來自HLA不匹配的供體的外周血單核細胞（PBMC)建立MLR，并 且在存在或不存在不同MSC:MLR比率下的生長抑制的MSC(growth-arrestedMSC)下培養。 免疫抑制測試方案如下：
[0270] 在范圍1.6xl05-2. 5xl04細胞/孔中的不同細胞數目下，將頂P的絲裂霉素C處 理的細胞接種在96孔板中并且允許附著過夜。然后，在1:2. 5的刺激物（stimulator):應 答物（responder)比率下，將單路MLR(one_wayMLR)添加至各孔。為了建立MLR，使2xl05 個應答物PBMC與之前已經用25mg/ml的絲裂霉素C處理0. 5小時的8xl04個異源刺激物 PBMC混合。將培養物維持5天，在此過程中用5-溴-2-脫氧尿苷（BrdU)進行脈沖持續最 終24h。根據制造商的說明，使用用于BrdU結合定量的比色免疫測試試劑盒（Calbiochem) 測定細胞增殖。在不存在頂P細胞的情況下培養的一組MLR孔認為是增殖對照。對于所有 測定，在補充有10%的FBS(Hyclone)、2mM的谷氨酰胺（Invitrogen)和0· 05mM的b-疏基 乙醇（Sigma-Aldrich)的RPMI1640培養基（Invitrogen)中一式三份進行處理。
[0271 ] 結果表明，頂P以劑量依賴方式抑制MLR中的異源淋巴細胞的增殖（圖11A)。
[0272] 評估PGE-2 :
[0273] 使用來自HLA不匹配的供體的外周血單核細胞（PBMC)建立MLR，并且使用以上描 述的方案，在不同MSC:MLR比率下在存在或不存在生長抑制的MSC下培養。在溫育5天結 束時，從96孔板的孔收集來自頂P-MLR共培養物的上清液，將收集的培養基在1500rpm下 離心下來并且儲存在_80°C下直至使用。根據制造商的說明，使用用于PGE-2的定量測定的 競爭性免疫檢測試劑盒（PGE-2EIA試劑盒，Enzo生命科學），測定上清液中PGE-2的水平。
[0274] 結果表明，當在存在淋巴細胞的情況下培養時，包括本公開的細胞的頂P產生大 量的PGE-2(圖11B)。PGE-2的分泌示出清楚的劑量反應，隨頂P細胞與異源PBMC的比率 而變化。在產生的PGE-2的量和頂P的免疫抑制能力之間看出正相關，在較高的PGE-2量 下獲得較大的免疫抑制（圖11C)。
[0275] 因此，包括本公開的細胞的IMP具有強效的免疫抑制能力以及分泌大量的免疫調 節細胞因子PGE-2。這些特性使得頂P適合在不相關的受體中移植，以及用于治療免疫相關 的疾病如移植物抗宿主病（graftversushostdisease) (GvHD)和其他自身免疫疾病。
[0276] 評估由最終產品產生的VEGF和sGAG的量，以分析頂P分別對于嚴重肢體缺血 (CLI)和骨關節炎（0A)的效力。
[0277] 評估VEGF:
[0278] 在傳代5次下，將按照本公開的方法[具有基于匯合的培養基改變方案，洗滌-II 的洗滌操作并且考慮實施例1的母液（master)和種子混合物制備]獲得的頂P解凍并且 在1百萬的密度下鋪板在T75燒瓶中。在48小時和72小時收集條件培養基（conditioned medium)，并且通過ELISA評估VEGF含量。這與獲得最終細胞組合物的先前已知的方法相 比較，其中，根據與匯合相對的天數進行過程培養基改變，隨后進行洗滌-I的洗滌操作，并 且其中，沒有進行母液和種子混合物制備。
[0279] 當遵循先前已知的方法和本公開的方法時，通過圖12提供了表明VEGF水平差異 的結果，其中，在按照本公開的方法獲得的細胞中提高了VEGF含量。
[0280] 以下是針對血管生成潛能評估VEGF的方案：
[0281 ] VEGF是強效血管生成標記物并且它們由BMMSC釋放支持旁分泌機制支持患者的 長期血管生成的生物學作用的觀點。在此，我們評估我們的MP(BMMSC)-P5培養物的條件 培養基中的VEGF的量。在1X106個細胞的密度下，一式兩份將BMMSC鋪板在T-75燒瓶（BD) 中。在48小時和72小時結束時，從用DMEM-KO、10 %的FBS、谷氨酰胺（Glutamax) (100U/ml)、青鏈霉素（50U/ml至100U/ml的青霉素和50μg/ml至100μg/ml的鏈霉素）和2ng/ ml的bFGF進料的T75燒瓶收集條件培養基。在傳代5次下，在80-90 %匯合下在收獲當 天，還從在細胞堆疊中培養的大規模生產批次中收集條件培養基。在1500rpm下，將收集的 培養基離心下來并且用〇. 22μ注射器式濾器（Millipore)過濾，儲存在-80°C下直至使用。
[0282] 根據制造商的說明，使用人VEGFQuantikineELISA試劑盒（R&D系統， Minneapolis，MN)。將200μ1的條件培養基用于測定。對于每一次運行，包括分離標準。使 用SpectramaxM3酶標儀，在450nm下讀取吸光度。
[0283] 評估sGAG:
[0284] 在傳代5次下，將按照本公開的方法[具有基于匯合的培養基改變方案，洗滌-II 的洗滌操作并且考慮實施例1的母液和種子混合物制備]獲得的MP解凍并且溫育用于軟 骨分化。在分化21天之后，評估sGAG和DNA。將最終的GAG值歸一化為DNA含量。這與獲 得最終細胞組合物的先前已知的方法相比較，其中，根據與匯合相對的天數進行過程培養 基改變，隨后進行洗滌-I的洗滌操作，并且其中，沒有進行母液和種子混合物制備（圖13)。 如可以注意到的，先前已知方法的值平均是22. 54±2. 983ug/ugDNA，而對于本公開的方法， 值平均是39. 38±5. 212ug/ugDNA，從而使得值顯著提高。
[0285] 由于軟骨形成和再生需要軟骨細胞，測定了BMMSC對于軟骨細胞分化的潛能。由 軟骨細胞生成的sGAG有助于穩定軟骨結構，并且因此，確定通過本公開方法生產的MSC是 否可以在體外條件下分化為軟骨細胞并且產生sGAG，將是重要的。建立了用于測定sGAG的 生物化學測定，其是重要的軟骨組分之一并且包括約3-6%的總軟骨組分。以下是評估GAG 含量的方案：
[0286] 1.在1000個細胞/cm2的密度下，將細胞鋪板在6孔板上（1組對照并且1組用于 分化）。
[0287] 2.測定進行兩次，包括2個孔用于sGAG評估，2個孔用于DNA評估，1個孔用于RNA 以及1個孔用于染色。
[0288] 3.在70%的匯合下，將細胞從對照孔胰蛋白酶化并且將球粒儲存在-80°C連同來 自sGAG孔的消耗培養基一起。
[0289] 4.使用來自GIBC0的STEMPRO試劑盒，溫育軟骨形成的分化。每個48小時進行 培養基改變。
[0290] 5.并且，允許細胞分化最高達21天。
[0291] 在第21天時，將細胞胰蛋白酶化并且在llOOrpm下離心下來收集，并且將干燥的 球粒儲存在-80 °C下直至測定。
[0292] 6.在測定當天，在冰上解凍樣品并且使用BLYSCAN試劑盒方案評估sGAG。根據方 案，在65°C下，將細胞球粒用木瓜蛋白酶溶解3小時，隨后用二甲基亞甲基藍染色。sGAG與 染料在酸性pH下反應并且產生在550nm下顯示吸收最大值差異的GAG-染料復合物。
[0293] 當遵循先前已知的方法和本公開的方法時，通過圖13提供了表明sGAG水平差異 的結果，其中，在按照本公開的方法獲得的細胞中提高了sGAG含量。
[0294] 實施例6：
[0295] 在-80。。下的直接穩定性（directstability)：
[0296] 通過冷凍-解凍活力、細胞恢復、解凍后的增殖、CFU-F和分化潛能，評估了本公開 的MSC在冷凍保存之后的效能。冷凍保存的MSC的較長的穩定性取決于冷凍保存培養基和 冷凍保存的過程或方法。
[0297] 加速穩定性：加速穩定性研究的標準操作包括控制速率冷凍（_80°C)，并且然后， 將小瓶轉移至液氮儲存，并且在一周之后再次從液氮儲存至_80°C深度冷凍以建立加速穩 定性條件。通常，在控制速率冷凍之后，必須將MSC放置在液氮中，并且在CRF之后，在-80°C 下細胞是高度不穩定的。
[0298] 直接穩定性：另一方面，本公開提供了直接穩定性（directstability)概念，其 中，與標準加速方法相比，MSC的較高的冷凍濃度加上穩定的方法/條件能夠提供更優異的 性能、效率和穩定性。總之，在不存在任何暴露于-196°C液氮的情況下，在CRF之后在-80°C 的直接加速條件下，該研究能夠建立在CZ小瓶中的藥物產品的活性物質（MSC)的保質期時 間段。在0.25億個細胞/ml的高密度下，當將MSC儲存在CZ小瓶中的CS5培養基中時，進 行了這些研究。
[0299] 與主要用于產品的運輸的短期儲存的先前已知的加速穩定性研究相比，MSC示出 了有前景的或更優異的結果。在大多數其他細胞治療行業中，控制速率冷凍在-135Γ下結 束，并且此后，MSC移至液氮。相反，MSC在-80°C下MSC的穩定性是獨特的，并且提供了在 并不使用價格昂貴的液氮的情況下短時間儲存和運輸的優點。
[0300] 加速過程和直接穩定過程的7AAD活力
[0301] 方案：收獲BM-MSC，并且在lxlO6個細胞/mL的濃度下再懸浮在洗滌緩沖液中。洗 滌緩沖液由補充有1% (v/v)的FBS和1% (w/v)疊氮化鈉的磷酸鹽緩沖鹽水（PBS)構成。 使用7-氨基放線菌素D(7AAD，其可以穿過死細胞的細胞膜），通過流式細胞儀測定細胞活 力。在室溫下，將100μ1的細胞懸浮液在黑暗中溫育10分鐘，3μ1的飽和濃度的7AAD在 96孔板的一個孔中并且未染色的細胞自動地在另一個孔中。首先在自動設置下運行流式細 胞儀，并且調節電壓和補償參數以落在柱狀圖中。以7AAD運行測試樣品，同