寸320JimX15cm， Micro-TechScientific,Vista,CA)。所有的運行注射體積都是10]11^，其中使用Leap Technologies(Carrboro，NC)的型號HTCPAL自動取樣器。使用0% -45 %的溶劑B的梯度 在52min實現膜蛋白酶膚的梯度洗脫（溶劑A是肥0中0. 1 %的甲酸，W及溶劑B是乙臘的 0. 1 %甲酸）。通過注入AQUA膚W及加大去簇電壓值巧和碰撞能量（CE)W使片段離子強 度最大化來確定MRM的條件。最終條件列在表1中。每個躍遷的駐留時間設定為50msW 及總的Qtrap循環時間為0. 77sec。
[0325]
[032引表1:S種0RF2膜蛋白酶膚W及其相應的AQUA膚的MRM條件。K*是C"Nis標記 的賴氨酸，R*是滬滬標記的精氨酸，W及I*是C"滬標記的異亮氨酸。經標記的氨基酸的 質量提高分別為8Da、10化、和7Da。 防327] 巧巧中0RF2濃麼的巧準梳準曲線、巧輪、巧確定
[032引 用0RF2滲入至"樣品5,230-64E"至預先確定的終濃度3. 125、6. 25、12. 5、25、50、 100、和200yg/mLW產生了校準標準曲線。將AQUA膚（200fmol/yL)加入至洗脫溶液（各 個濃度點）W作為內部標準。使用ABIMulti如ant軟件（版本1.0,ABSCIEX，500Old ConnecticutPath,Rramin曲am,MA01701,USA)來積分對躍遷所記錄的峰面積應答。所有 膚的積分參數設定如下：總平滑寬度（totalsmoothingwi化h)，3個點；RT窗口，120sec; 最小峰寬度，3品脫；最小峰高度，Ocps;噪音百分比，40% ;基線子窗口，2min;峰分離因子， 2個點。0RF2膚與AQUA膚的積分的峰面積比例（y軸）針對0RF2(x軸）的濃度作圖，并且 演算得到了線性擬合標準曲線（y=mx+b)。使用標準曲線計算了 0RF2疫苗濃度和64、32 和16yg/mL的校驗樣品。 防32引巧巧系列稀釋曲線
[0330]用樣品 230-64E將疫苗 261-007B-1、261-007C-1、261-007D-1、261-007F-1 稀釋 2、 4、8、16、和32倍。使用樣品 230-61(：將疫苗 261-0078、261-007(：、261-0070、261-007。稀釋 2、4、8、16、和32倍。使用與上文所述相同的方案處理和分析了稀釋和未稀釋的樣品。
[0331] 結果 防33引洗擇膀帝白酶化用于MRM臨測
[0333] 在化bitrap質譜上分析純化的0RF2蛋白的膜蛋白酶消化物進行膚的鑒別。選擇 了 =種膜蛋白酶序列用于AQUA膚合成W及MRM監測，運是由于其強烈的和相對清晰的信號 特征。在兩個y-離子躍遷監測每種膚（參見表1)。另外，合成了膚ISIP陽YYR膚（SEQID N0:26)的延長版本（GGGTNK[IC"n15]S[IC"n15]P陽YYRI服VKVE巧（SEQIDN0:28)。此膚含 有兩個膜蛋白酶切割位點。計算了穩定同位素標記的膚[IC"n15]S[IC"n15]PFEYYR(SEQID N0:4)與膚ISIP陽YY[RC"Nis](SEQIDN0:4)的信號比例，W評估消化效率。在結果部分， 我們會僅討論與膚NVDHVGLGTAFENSK(沈QIDN0:4)和VEFWPCSPITQGDR(沈QIDN0:24)相 關的數據。ISIP陽YYR膚（SEQIDNO: 26)在討論部分進行論述。
[0334] 梳準曲線
[033引 分別對膚NVDHVGLGTAFENSK(沈QIDNO: 4)和VEFWPCSPITQGDR(沈QIDNO: 24)的 躍遷 794. 4/1023. 5、794. 4/853. 4、846. 9/1131. 5 和 846. 9/786. 4 生成了 四個標準曲線。沒 有數據點加了權重。將簡單的線性擬合應用于所有數據點。每個曲線的R-square在0.99 之上。S個重復樣品（包括所有加工步驟）的變異系數（CV)范圍從1%到12%，其中大部 分數據在10%之下。圖1顯示了一組數據在794. 4/1023. 5和794. 4/853. 4的躍遷的整合。 參見圖2為標準曲線，表2為平均比例和計算的CV，W及表3為計算的誤差百分比。
[0336] (a)
[0337]
[033引化）
[0339]
[0340] 表2:脈沖AQUA膚強度的平均比例W及標準曲線的CV。（a)膚 NVDHVGLGTAFENSK(沈QIDN0:4)的數據；(b)膚VEFWPCSPITQGDR(沈QIDN0:24)的數據。
[0341] 使用所演算的標準曲線，對每個濃度點計算了誤差的百分比（表3)。除了膚 NVDHVGLGTAFENSK(沈QIDN0:4)的最低濃度，誤差百分比的絕對值范圍在1%至22%，其中 大部分數據在15%之下。
[0342] (a)
[0343]
[0346]表3:標準曲線中使用的每個濃度點的誤差百分比。（a)膚NVDHVGLGTAFENSK(SEQ IDN0:4)的數據；(b)膚VEFWPCSP口QGDR(沈QIDN0:24)的數據。 防347] 梳準曲線的巧輪
[034引使用立個QC溶液（0RF2濃度濃度為16yg/血、32yg/血和64yg/血）來校驗曲 線。每個濃度點獨立處理和分析S次。數據的CV低于8%。誤差百分比的絕對值范圍在 1%至12%，其中大部分數據低于10% (表4)。
[0349] (a)
[0350]
[0354]表4:校驗QC樣品的誤差百分比。（a)衍生自膚NVDHVGLGTAFENSK(SEQIDNO: 4) 標準曲線的數據。（b)衍生自膚VEFWPCSP口QGDR(SEQIDNO: 24)標準曲線的數據 防3巧]巧巧230-61A中的0RF2濃麼
[0356] 疫苗230-61A樣品被獨立處理和分析S次。使用衍生自膚NVDHVGLGTAFENSK(沈Q IDN0:4)和VEFWPCSPITQGDR(SEQIDN0:24)的標準曲線確定0RF2濃度。絕對值和CV在 表5中示出。
[0357] (a)
[035引
[0359] (b)
[0360]
[0361] 表5:疫苗230-61A中0RF2蛋白的濃度.（a)衍生自膚NVDHVGLGTAFENSK(沈QID N0:4)標準曲線的數據。（b)衍生自膚VEFWPCSP口QGDR(SEQIDN0:24)標準曲線的數據。 陽36引巧白巧雙巧白
[0363]制備了空白（沒有0RF2，但有添加的AQUA膚）和雙空白（連AQUA膚也沒有）樣 品（230-64巧用于研究。比較了空白和雙空白軌跡至標準曲線的最低點（3. 125iig/mL濃 度）（膚NVDHVGLGTAFENSK(沈QIDN0:4)和VEFWPCSPITQGDR(沈QIDN0:24)躍遷的層析 沒有示出）。躍遷少于1 %的干擾被監測。 陽364] 巧巧系列稀釋曲線
[0365]使用樣品 230-64E將疫苗 261-007B-U261-007C-U261-007D-1、和 261-007F-1 系列給稀釋了 2、4、8、16、和32倍。使用樣品230-61C將疫苗261-007BJ61-007C、 261-0070、和261-007。系列給稀釋了2、4、8、16、和32倍。每個濃度點獨立處理。所提取 的質量選擇的疫苗231-007B-1和疫苗231-007B的MRM色譜沒有示出。將內源0RF2膚的 峰面積與AQUA膚的峰面積的比例針對相對濃度（其中起始濃度定義為1)為261-007-1 系列，膚NVDHVGLGTAFENSK(沈QIDN0:4) ;261-007-1 系列，膚VEFWPCSP口QGDR(沈Q IDNO:24) ;261-007 系列，膚NVDHVGLGTAFENSK(沈QIDNO:4);和 261-007 系列，膚 VEFWPCSPITQGDR(沈QIDNO:24)作圖。
[0366] 基于此前所做的化ISA數據，0RF2濃度在每組疫苗內有微小變化，其中F具有最 高的0RF2濃度W及B具有最低的0RF2濃度。MRM結果與化ISA數據一致。
[0367] 討論 陽36引ISIP陽YYR化（SEQIDN0:26)
[0369] ISIP陽YYR膚（SEQIDN0:26)在選擇用于對0RF2濃度進行定量的S個膚中具有 最強的信號。然而，其由于W下原因而被放棄。首先，其標準曲線是顯著非線性的，顯示飽 和的趨勢。其次，疫苗稀釋系列顯示了異常的趨勢，如1/2稀釋點具有比未稀釋的疫苗更高 的比例。此種行為表明該膚與豬血清蛋白的一些相互作用。 370] 消化效率巧一致忡
[037。合成了更長版本的ISIP陽YYR膚（SEQIDN0:26)，其中有穩定同位素標記的 異亮氨酸插入到序列中。其序列是（GGGTNK[IC"n1s]S[1滬滬]P陽YYRI服VKVE巧（SEQ IDN0:28)。此膚含有兩個膜蛋白酶消化位點。在完全的膜蛋白酶消化之后，此更長的 膚轉變為[IC"n15]S[IC"n15]P陽YYR(沈QIDN0:4)。計算了此膚的MRM躍遷與AQUA膚 ISIP陽YY[RC"Nis](SEQIDN0:26)的MRM躍遷的比例，W確定膜蛋白酶消化效率和一致性。 來自標準曲線系列的比例（數據未顯示）顯示此長膚的消化效率為大約2-2.5%。42個數 據點的消化變異低于15%。此長膚低消化效率的一個可能解釋是因為，其可能不具有完美 的膜蛋白酶消化位點。完整0RF2蛋白的膜蛋白酶消化效率可W很不同并且比此膚高很多。
[0372] 益結
[0373] 最初由ABIMulti如ant軟件（版本1. 0)建議為最可能在本發明中有用的S個膜 蛋白酶膚中的兩個表現正如預期。出乎意料的是，雖然ISIPFEYYR膚（SEQIDN0:26)在選 擇用于在起始的實驗中對0RF2濃度進行定量的S個膚中具有最強的信號，但是其卻未能 具有用于定量分析所需的特征，或許是由于未預料到的與豬血清蛋白的相互作用。
[0374]連施倆I2:MRM的樣品制備
[037引用于分離病毒樣顆粒和膜蛋白酶消化（用于MRM)的SEC-MRM方法
[0376] 反轉CHROMASPIN柱若干次W完全使凝膠基質重懸浮。
[0377] 首先從柱去除頂部的蓋子，并繼而去除底部的蓋子。留住蓋子。將柱的底部端輕 柔地（貼住，但卻并不緊）置入到所提供的一個2-ml的微型離屯、機管。
[037引在搖擺籃轉子中或者在固定角度轉子中W700Xg將所述柱離屯、3min。
[0379] 從所述2-ml的管棄去所收集的緩沖液。輕柔地將所述柱再置于所述管中。加入 1ml的PBS至凝膠。
[0380]在 700xg再次離屯、3min。
[038。將2-ml的收集管清空并將所述住再次置入相同的2-ml管。
[0382] 加入1ml的PBS至凝膠并在700xg再次離屯、3min。
[0383] 將2-ml的收集管清空并將所述柱輕柔的再次置入相同的2-ml管。在700xg再 次離屯、3minW從所述柱中去除剩余的PBS。
[0384] 將旋轉柱置入第二個2-ml微型離屯、機管。小屯、地并且緩慢地將70yL樣品載入 到凝膠層平整表面的中屯、。不要讓任何樣品沿著柱的內壁流動。
[038引 W700xg離屯、3min.
[0386] 微離屯、管含有VLP。
[0387] 將10ii1的VLP轉移至96孔平板。
[038引加入100y1的Master溶液（含有0. 1 %RapiGest)至平板的每個孔。
[0389] 加入10y1的0. 1MDTT并簡短滿旋。用蓋子蓋住所述平板并在37攝氏度溫育 40min。
[0390] 加入的0.1MIAA。用蓋子蓋住所述平板并在室溫于恒定滿旋下溫育 0.化H保持在黑暗中）。
[03川加入15y1的8iig/ml膜蛋白酶（0. 8yg/y1在最終溶液中）并簡短滿旋。用蓋 子蓋住所述平板并在37攝氏度溫育16虹。
[039引加入15y1的肥1 (2M)并簡短滿旋。用蓋子蓋住所述平板并在37攝氏度溫育1虹.
[0393] 過濾提取物并注射20yL至HPLCW及監測ABSciex5000上MRM躍遷。
[0394] 免疫沉淀畑）方法
[039引1.通過將300y1的加樣緩沖劑加入至每個孔，包被96-個位置的、Immulon1B平 底微量滴定介質結合聚苯乙締平板。在室溫溫育lOmin。棄去加樣緩沖劑并讓平板干燥。[0396] 2.如本文所指引的那樣稀釋所有樣品。取10yL的樣品至LoBindEppendoff小 管。加入490 的加樣緩沖劑。通過滿旋混合好。
[0397] 3.取50yL等分試樣的稀釋樣品加至預包被的96-個位置的平板的每個孔。
[039引 4.向每個孔加入10y1的多克隆抗體（pAb)(加樣緩沖劑中0. 7mg/mL)。
[0399] 5.伴有中等速度的滿旋在室溫溫育化。
[0400] 6.向每個孔添加100y1的蛋白G珠（加樣緩沖劑中6mg/mL)。
[0401] 7.伴有中等速度的滿旋在室溫溫育化。
[040引 8.用洗涂緩沖液洗涂四次，并在每次洗涂之間進行滿旋。
[0403] 9.向每個孔添加25y1的RapiGest溶液。
[0404] 10.向每個孔添加10y1的工作標準溶液（50mM碳酸氨錠中1yg/血）。
[0405] 11.向每個孔添加10y1的0. 1MDTT。
[0406] 12.使用Thermomixer.在60°C伴有速度650RPM的滿旋下溫育比。
[0407] 13.向每個孔添加25U1的0.1MIAA。
[0408] 14.在黃光室內于室溫伴有中等速度的滿旋溫育1/化。
[0409] 15.向每個孔添加10yL的膜蛋白酶溶液（0. 5mg/mL)。
[0410] 16.在37°C伴有中等速度的滿旋溫育過夜（16h)。
[0411] 17.向每個孔添加10y1的3M肥1。
[0412] 18.在37°C于室溫伴有中等速度的滿旋溫育1/化。
[0413] 19.將所有樣品轉移至多層篩HST過濾平板（該過濾平板用膠帶與96個位置的 2. 0血錐形孔平板綁在一起）。于3000RPM離屯、3min。
[0414] 使用自動化的實驗室樣品操控平臺的自動取樣器方法將樣品注射入HPLC柱
[0415]
[0417] 層析
[0418]
[0419] 分析累程序-步驟表1:
[0420]
陽4幼質譜
[0426]
[0427] 使用了W下電噴霧電離源參數：駐留時間，所有MRM躍遷50ms;電離噴射電壓， 5000V;離子源溫度，550°C;簾氣體（CUR)，20.DP:去簇電壓。CE:碰撞能量。CXP:碰撞室逃 逸電壓。
[0428]
[0429] 尺寸排阻層析（SEC)-MRM
[0430] 使用SEC確保了要測量的樣品中僅存在VLP或者CLP,因為只有完整的VLP或CLP 結構會通過而進入空隙級分。EC-MRM使得可W將VLP從具有高水平的不相關、外源蛋白的 復雜基質中分離。此方法中無抗體。如果有可能存在含有完整VLP和降解的VLP的抗原批 次，那么加入SEC步驟可確保在測定的MRM部分僅測量完整VLP(也即，真的VLP)。
[0431]連施例3:使用在無包膜PCV2 0RF2VLP上的IP-MRM對PCV2a和PCV2b定量區分
[0432]PCV2a和PCV2b是抗原性相似但不同的VLP的抗原性亞型。類似地，PCV2a0RF2和 PCV化0RF2VLP亞型是抗原性相似的，但在氨基酸水平卻并是不同的。期望的PCV2 0RF2 疫苗將含有VLP的混合物其包含PCV2a0RF2和PCV化0RF2運兩種亞型。
[0433] 通常，會使用ELISA方法來確定疫苗中兩種不同的PCV2 0RF2亞型的相對抗原含 量（RAC)或相對效力（RP)。然而，能夠區分內含物水平的PCV2a和PCV化的化ISA將會需 要兩種不同的MAb(-種MAb僅與PCV2a反應，而另一種MAb僅與PCV化反應）。但是，能夠 區分兩種抗原性相似的PCV2a和PCV化VLP的兩種獨特MAb的產生將會是非常困難的，也 有可能是無法實現的任務。
[0434]IP-MRM允許使用多克隆抗體來結合PCV2a和PCV2b，隨后通過MRM進行接下來的 區分W及對PCV2a和PCV2b量的定量。
[0435] 本文公開的和要求保護的所有組合物及方法可W在了解到本公開的情況下無需 進行過度的實驗即可制得和執行。當本發明的組合物和方法被描述為優選的實施方案時， 對于本領域技術人員而言明顯可W對所述組合物和方法W及對方法的步驟或步驟的順序 進行變化，而同時又不偏離本發明的概念、主旨和范圍。更具體地說，明顯可W將本文所述 的物質替換為某些化學上和生理學上相關的物質但同樣能實現相同的或類似的結果。所有 對本領域技術人員而言很明顯的此類相似的替代和改變都應認為是在由W下權利要求所 限定的本發明的主旨、范圍和概念之內的。
【主權項】
1. 對樣品中一或多種病毒蛋白的存在進行定量的方法，其包括： a. 向樣品中加入已知量的至少一種穩定同位素標記的特征肽，所述特征肽特異于至少 一種病毒蛋白； b. 用蛋白酶消化所述樣品； c. 對所述樣品運行質譜分析；和 d. 確定所述樣品中病毒蛋白的量。2. 權利要求1的方法，其中所述一或多種病毒蛋白能夠形成病毒樣顆粒，和/或其中所 述樣品包含病毒樣顆粒，所述病毒樣顆粒包含多個所述一或多種病毒蛋白，優選包含PCV2a 0RF2 和 / 或PCV2b0RF2。3. 權利要求1或2的方法，其中確定所述樣品中病毒蛋白的量包括：通過比較樣品質 譜分析的結果來確定所述樣品中病毒蛋白的量，其中優選在質譜分析中將穩定同位素標記 的特征肽的信號與所述樣品的蛋白酶消化所產生的一或多種肽的信號進行比較，特別是與 所述樣品中一或多種病毒蛋白的蛋白酶消化所產生的一或多種肽的信號進行比較。4. 權利要求1-3中任一項的方法，其中所述特征肽通過以下方式而預先選擇：確定它 們特異于要進行定量的病毒蛋白的蛋白酶消化物，和/或確定在所述病毒蛋白缺失時它們 從所述樣品的蛋白酶消化物中特異性缺失。5. 權利要求1-4中任一項的方法，其還包括： a. 通過將樣品的質譜分析結果與校準標準曲線比較來確定所述樣品中病毒蛋白的量； 和/或 b. 對含有已知量的標記的和/或未標記的特征肽的標準物運行質譜分析；和 c. 通過將樣品質譜分析的結果與標準物的結果比較來確定所述樣品中病毒蛋白的量， 其中優選用標準物的結果生成校準標準曲線并與樣品質譜分析的結果進行比較。6. 權利要求1-5中任一項的方法，其中所述樣品是制劑的樣品，并且其中優選所述制 劑是疫苗制劑和/或其中所述樣品是疫苗制劑樣品。7. 權利要求6的方法，其中所述制劑含有結合所述病毒蛋白的物質。8. 對制劑的樣品中一或多種病毒蛋白的存在進行定量的方法，其中所述制劑的樣品含 有結合所述病毒蛋白的物質，所述方法包括： a. 用蛋白酶消化所述樣品； b. 向所述樣品加入已知量的至少一種穩定同位素標記的特征肽，所述特征肽特異于至 少一種病毒蛋白，其中所述特征肽通過確定以下而預先選擇： i. 所述特征肽特異于要定量的病毒蛋白的蛋白酶消化物； ii. 在所述病毒蛋白缺失時，所述特征肽從所述制劑的蛋白酶消化物中特異性缺失