疫苗組合物定量的制作方法
【專利說明】疫苗組合物定量
【背景技術】
[0001] 為了減少動物的壓力W及節省勞動力成本，期望用盡可能少的劑量給動物接種疫 苗W達到效果。期望有針對多種病原體的組合疫苗遞送有效量的針對各病原體的抗原。從 業者和生產者可W在即將接種疫苗前通過混合針對多個各種病原體的抗原來實現組合疫 苗。但是，本領域的此種制備可W引起混合誤差，而且并不確定抗原的組合彼此之間能相 容。
[0002] 期望會有針對多種病原體的預混合的組合疫苗，從而可W降低潛在的劑量誤差并 且針對各種病原體的有效劑量的抗原能夠可靠地遞送至對象。
[0003] 為了降低生產成本，期望疫苗生產流水線化。例如，在收獲前或者在將多種免疫原 性組合物混合在一起之前檢查所期望的免疫原性材料的細胞培養物的質量，能夠減少差異 和浪費。
[0004] 為了獲得治療性免疫原性組合物（例如，疫苗）的監管許可，W及基于安全的原 因，需要監控抗原質量和組合物穩定性的手段。從歷史上來說，該方法都是基于化ISA的。 ELISA需要使用針對所要測量抗原的適宜抗體。但是，基于化ISA的方法會遇到一些阻礙： (1)并不是總有適宜的抗體可用；W及（2)運些方法并不總是能夠對復雜的生物治療劑進 行可靠的定量和準確的定量（例如±10%的偏差）。在疫苗中存在多種抗原時，后面運種 阻礙尤其會成問題。
[0005] 然而，對于要成為商業產品的組合疫苗，組合抗原的參考穩定性必須在該組合中 能夠得到確認。也即，各抗原在混合之后其每個的量都必須是隨著時間能夠確定的，W確保 每個劑量中存在期望量的各種抗原。
[0006] 在一些組合疫苗中，個別疫苗制劑可能含有元件，其干擾其它疫苗成分使用標準 技術的檢測。例如，組合疫苗可含有第一種和第二種抗原，其中第二種抗原配方中可能包括 來自動物的血清，所述動物已暴露于含第一種抗原的生物體，或者所述動物已接受過與第 一種抗原相同的或抗原性類似的抗原的接種。在運種情況下，第一種抗原可能已經激發了 特異于該第一種抗原的競爭性抗體的產生；因而，第二種抗原配方中存在的血清可能含有 針對第一種抗原的抗體并且運些抗體也可存在于所述組合疫苗中。因此，用于在單一組分 疫苗中監測第一種疫苗的參考穩定性的標準免疫學手段（也即，ELISA)將不足W確定所得 的組合疫苗的穩定性。在缺乏適宜的化ISA測定法的情況下，將在宿主動物中進行臨床研 究來確定抗原的穩定性和疫苗的效力。所述臨床研究會涵蓋統計學上相當數量的動物在受 攻擊之后的疫苗接種。進行臨床研究是昂貴的，包括動物的花費、對合適住房（生物容納） 的需求、W及在研究期間對收集的臨床樣品的測試。需要另外的手段，其適于檢測大規模生 產W及適于可靠地確定組合疫苗中各種抗原的最終濃度。
[0007] 發明概述
[000引本發明提供了方法和組合物，例如，優選經標記的特定的膚，用于在所述方法中對 樣品中的一或多種目標蛋白（優選病毒蛋白）的存在進行定量，優選所述樣品是含有結合 所述目標蛋白的物質的制劑的樣品，其中使用質譜分析所述樣品W及優選含有已知量的標 記的或未標記的特征膚（si即aturep巧tide)的標準物。
[0009] 在優選的實施方案中，本發明是對制劑樣品中的一或多種病毒蛋白的存在進行定 量的方法，所述制劑中含有結合所述病毒蛋白的物質，所述方法包括：
[0010] (a)用蛋白酶消化所述樣品；
[0011] 化）加入已知量的至少一種穩定同位素標記的特征膚，其特異于所述樣品中的至 少一種病毒蛋白，其中所述特征膚是通過確定W下而經過預先選擇的：
[0012] i.所述特征膚特異于要定量的病毒蛋白的蛋白酶消化物；
[0013] ii.在所述病毒蛋白缺失時，所述特征膚從所述制劑的蛋白酶消化物中特異性缺 失；
[0014] iii.所述特征膚在質譜分析中產生強信號；和
[0015] iv.所述特征膚在質譜分析中產生可區別的信號；
[0016] (C)對所述樣品和含有已知量的標記的和未標記的特征膚的標準物運行質譜分 析訊
[0017] (d)通過比較樣品質譜分析的結果和標準物的結果確定所述疫苗 [001引制劑樣品中所述病毒蛋白的量。
[0019] 在另外的優選實施方案中，所述蛋白是豬圓環病毒（PCV)的0RF2。
[0020] 在另外的優選實施方案中，所述蛋白是PCV2的0RF2,所述特征膚是W下的一或多 種：
[0021] i.NVDHVGLGTA陽NS怔滬滬](沈QIDNO: 4)，和
[0022] ii.VEFWPCSPITQGD[RC"Ni5](SEQIDN0:24)。
[0023] 在另外的實施方案中，蛋白是PCV2亞型，例如，PCV2a和PCV化的0RF2的混合物。
[0024] 在另外的優選實施方案中，所述方法還包括：在蛋白酶消化之后，免疫純化所述病 毒蛋白消化物，或者使所述制劑通過尺寸排阻層析柱并基于分子大小從含有制劑中其它化 合物的級分中選擇出從柱洗脫下的含有病毒蛋白的級分。
[0025] 在另外的實施方案中，使用至少兩種穩定同位素標記的特征膚，其中第一種特征 膚用于對制劑中的病毒膚進行定量而第二種特征膚用于對制劑中的膚的穩定性進行定性 測定。
[0026]另一個實施方案是制備含有一或多種病毒免疫原的疫苗制劑或免疫原性制劑的 方法，其中所述疫苗或免疫原性制劑含有結合第一種免疫原性組合物中病毒蛋白的物質， 所述方法包括使用多反應監測-質譜（MRM-M巧W用于一或多種制劑的定性和定量測定或 者用于質量控制測定。免疫原性組合物可包含病毒抗原和/或細菌抗原。
[0027] 另一個優選的實施方案包括上文所述的方法，其中MRM-MS包括：
[002引（a)用蛋白酶消化疫苗或免疫原性制劑的樣品；
[0029] 化）向所述樣品中加入已知量的至少一種穩定同位素標記的特征膚，所述特征膚 特異于至少一種病毒蛋白，其中所述特征膚是通過確定W下而預先選擇的：
[0030] i.所述特征膚特異于所要定量的病毒蛋白的蛋白酶消化物；
[0031] ii.在所述病毒缺失時，所述特征膚從所述制劑的蛋白酶消化 [003引物中特異性缺失；
[0033]iii.所述特征膚在質譜分析中產生強信號；和
[0034] iv.所述特征膚在質譜分析中產生可區別的信號；
[0035] (C)對所述樣品和含有已知量的標記的和未標記的特征膚的標準物運行質譜分 析訊
[0036] (d)通過比較樣品質譜分析的結果和標準物的結果確定所述疫苗制劑樣品中所述 病毒蛋白的量
[0037] 另一優選的實施方案包括上文所述的方法，其中所述運行質譜分析包括：
[0038] (a)將所述樣品離子化；
[003引 化）根據它們的質量或質荷比來分離多種離子訊
[0040] (C)確定對應于所述病毒蛋白的至少一種離子。
[0041] 在特別優選的實施方案中，本發明是選自由W下組成的組的分離的質量標記的 (mass-labeled)月太：
[0042] a.NVDHV化GTA陽NS怔滬滬](SEQIDNO: 4)，
[0043]b.VEFWPCSPITQGD[RC"n15](SEQIDNO: 24)，
[0044] c.SVPFEYY[RC'￥?](SEQIDNO:27),
[0045] d.HTITQPFSY服[RC"n15](沈QIDNO:巧），
[0046] e.TFGYTV[KC"n15](沈QIDN0:5),
[0047] f.ATTVTTPSWAVDMM[RC"n15](沈QIDNO: 6)，
[0048] g.FNI孤FVPPGGGTNKISIP陽YY[RC"n15](SEQIDN0:7),
[0049] h.ATALTYDPYVNYSS[RC"n15](沈QIDNO: 8)，
[0050] i.HTIPQPFSYHSR(SEQIDN0:9),
[0051] j.YFTPKPVLDSTIDYFQP順[KC"n15](沈QIDNO: 10)，
[0052] k.VTMYVQF[RC"n15](SEQIDNO: 11)，
[0053] 1.MTTVTTPSWNVDMM[RC13n15](沈QIDNO:。），
[0054] m.FNIND化PPGGGSNPLTVP陽YY[RC13n15](SEQIDNO: 13)，
[00巧]n.ANALTYDPYVNYSS[RC"n15](沈QIDNO: 14)，
[0056] o.YFTP[KC"n15](SEQIDNO: 16)，
[0057] p.PVLD[RC"n15](沈QIDNO: 17)，
[0058] q.LQTTGNVDHV化GTAFENSIYDQDYNI[RC"n15](SEQIDNO: 18)，
[0059] r.ITMYVQF[RC"n15](沈QIDN0:19),
[0060] s.EF化[KC"n15](SEQIDNO: 20)，
[0061] t.DP化NP[KC"n15](沈QIDN0:21),
[0062] u.YFTPKPVLD[RC'￥?](SEQIDNO:22),
[0063] V.EFNLKDPPLNP[KC'￥?](SEQIDNO:23),
[0064] w.VEFWPCSP口QGD[RC"n15](SEQIDNO: 24)，
[0065] X.GVGSTAVIL孤NFVT[KC"n15](沈QIDN0:2W，及其組合。
[0066] 附圖簡述
[0067] 圖1來自一組標準曲線數據的膚的引出躍遷（extractedtransition)的質量層 析圖。（a)膚NVDHVGLGTAFENSK(SEQIDN0:4)的躍遷。對躍遷794. 4/1023. 5的峰面積進行 積分（交叉格）。其它=個軌跡（trace)對應躍遷794. 4/853. 4 (粉紅）、798. 4/1031. 5 (澄 色）、798. 4/861. 4(綠色）；（b)膚VEFWPCSPITQGDR(SEQIDN0:24)的躍遷，對躍遷 846. 9/1131. 5的峰面積進行積分（交叉格）。其它=個軌跡對應躍遷846. 9/786. 4 (粉紅）、 851. 9/1141. 5 (澄色）、851. 9/796. 5 (綠色）。
[0068] 圖2:0RF2的標準曲線。加標的（spikedin)0RF2濃度標示于X軸。0RF2膚對 AQUA膚的峰面積比標示于y軸上。（a)膚NVDHVGLGTA陽NSK(SEQIDN0:4)的標準曲線，包 括躍遷1燈1)和躍遷2燈2);化）膚VEFWPCSPITQGDR(SEQIDN0:24)的標準曲線，包括躍遷 1燈1)和躍遷2燈2)。
[0069] 圖3:PCV2a與PCV2b0RF2的氨基酸序列比對。針對所述序列的特征膚標注如下：
[0070]-澄色框：針對PCV2a和2b兩者的共同的膚：VEFWPCSP口QGDR(沈QIDN0:24)
[0071]-粉紅框：PCV2a-特異的膚：ISIP陽YYR(SEQIDN0:26)
[0072]-藍色框：PCV2a-特異的膚：NVDHV化GTA陽NSK(SEQIDN0:4)
[0073]-綠色框：PCV2b-特異的膚：SVP陽YYR(沈QIDNO: 27)
[0074]-紫色框：PCV2b-特異的膚：HTITQPFSY服R(沈QIDN0:15)
[00巧]發明詳述
[0076] 本發明基于W下出乎意料的發現：質譜分析（特別是通過使用多反應監測-質譜 (MRM-M巧）適宜用于W充分的方式對病毒蛋白（特別是病毒樣顆粒（VL巧例如由兩種不同 病毒蛋白組成的VL巧的量進行定量，特別還是在包括結合所述病毒蛋白和VLP的抗體的樣 品中。
[0077] 本發明因而設及在樣品中來自傳染原（infectiousagent)的一或多種蛋白（天 然的或重組的）的存在進行定量的方法，所述傳染原例如病毒、細菌、支原體、航蛋白、或寄 生蟲，所述方法包括
[0078] (a)向樣品加入已知量的至少一種穩定同位素標記的特征膚，所述特征膚特異于 至少一種傳染原蛋白.
[0079] 化）用蛋白酶消化所述樣品；
[0080] (C)對所述樣品運行質譜分析；和
[0081] (d)確定所述樣品中傳染原蛋白的量。
[0082] 在一個方面，本發明因而設及對樣品中一或多種病毒蛋白的存在進行定量的方 法，包括：
[0083] (a)用蛋白酶消化所述樣品；
[0084] 化）向樣品中加入已知量的至少一種穩定同位素標記的特征膚，所述特征膚特異 于至少一種病毒蛋白.
[0085] (C)運行所述樣品的質譜分析，優選通過使用多反應監測-質譜（MRM-M巧；和
[0086] (d)確定所述樣品中病毒蛋白的量。
[0087] 所述樣品特別是制劑的樣品，其中優選所述制劑是疫苗制劑。更優選地，所述樣品 是疫苗制劑樣品。
[0088] 在特別優選的實施方案中，本文所述的制劑含有結合所述一或多種病毒蛋白的物 質，其中所述物質優選為抗體。
[0089] 在本發明的情形中，特別需要理解的是術語"質譜（mass-spectroscopic)"等價于 術語"質譜測定（mass-spectrometric)"。
[0090] 根據本發明優選的實施方案，所述一或多種病毒蛋白能夠形成病毒樣顆粒，和/ 或所述樣品包括病毒樣顆粒，所述病毒樣顆粒包含多個所述一或多種病毒蛋白，優選包含 PCV2a0RF2 和 / 或PCV2b0RF2。
[0091] 所述確定所述樣品中病毒蛋白的量具體而言包括或由W下組成：通過比較樣品質 譜分析的結果來確定所述樣品中病毒蛋白的量，其中優選在質譜分析中將穩定同位素標記 的特征膚的信號與所述樣品的蛋白酶消化所產生的一或多種膚的信號進行比較，特別是與 所述樣品中一或多種病毒蛋白的蛋白酶消化所產生的一或多種膚的信號進行比較。
[0092] 優選地，所述特征膚通過W下方式而預先選擇：確定它們特異于要進行定量的病 毒蛋白的蛋白酶消化物，和/或確定在所述病毒蛋白缺失時它們從所述樣品的蛋白酶消化 物中特異性缺失。
[0093] 根據另一優選的方面，本發明對樣品中的一或多種病毒蛋白的存在進行定量的方 法還包括：通過將樣品的質譜分析結果與校準標準曲線比較來確定所述樣品中病毒蛋白的 量；和/或對含有已知量的標記的和/或未標記的特征膚的標準物運行質譜分析；和通過 將樣品質譜分析的結果與標準物的結果比較來確定所述樣品中病毒蛋白的量，其中優選用 標準物的結果生成校準標準曲線并與樣品質譜分析的結果進行比較.
[0094] 在另一方面，本發明還設及制備含有一或多種病毒疫苗的疫苗制劑的方法，包括 使用多反應監測-質譜（MRM-M巧來用于一或多種制劑的定量和/或定性測定或者用于質 量控制確定。
[0095]優選所述疫苗制劑含有結合病毒疫苗中病毒蛋白的物質，優選抗體。
[0096] 如本文所述的物質結合病毒蛋白的親和常數，優選在105m〇r1至10i2m〇r1或更高 的范圍內。
[0097] 在優選的方面，制備本發明的疫苗制劑的方法優選包括W下步驟：
[0098] (a)向樣品中加入已知量的至少一種穩定同位素標記的特征膚，所述特征膚特異 于至少一種病毒蛋白.
[0099] 化）用蛋白酶消化所述樣品；
[0100] (C)對所述樣品運行質譜分析；和
[0101] (d)確定所述疫苗制劑中的病毒蛋白的量。
[0102] 優選地，所述確定所述疫苗制劑中的病毒蛋白的量包括或由W下組成：通過比較 樣品質譜分析的結果來確定所述疫苗制劑樣品中的病毒蛋白的量，其中優選在質譜分析中 將穩定同位素標記的特征膚的信號與樣品的蛋白酶消化產生的一或多種膚的信號進行比 較，特別是與樣品中一或多種病毒蛋白的蛋白酶消化所產生的一或多種膚的信號進行比 較。
[0103] 在制備本發明疫苗制劑的方法的另一個優選方面，所述特征膚通過W下方式而預 先選擇：確定它們特異于要進行定量的病毒蛋白的蛋白酶消化物，和/或確定在所述病毒 蛋白缺失時它們從所述樣品的蛋白酶消化物中特異性缺失。
[0104] 根據特別優選的方面，制備本發明的疫苗制劑的方法還包括：通過將樣品的質譜 分析結果與校準標準曲線比較來確定所述疫苗制劑中病毒蛋白的量；和/或對含有已知量 的標記的和/或未標記的特征膚的標準物進行質譜分析；和通過將樣品質譜分析的結果與 標準物的結果進行比較來確定所述疫苗制劑樣品中所述病毒蛋白的量，其中優選用標準物 的結果生成校準標準曲線并與樣品質譜分析的結果進行比較。
[0105] 根據特別優選的方面，如本文所述的一或多種病毒蛋白，是一或多種病毒衣殼蛋 白，優選豬圓環病毒（PCV)的0RF2或豬細小病毒（PPV)的VP2。
[0106] 優選地，如本文所述的特征膚，是W下穩定同位素標記的膚中的一種或多種：
[0107]NVDHVGLGTA陽NSK佛QIDNO: 4)，
[0108]TFGYTVK(SEQIDNO:5)
[0109]ATTVTTPSWAVDMR(SEQIDNO:6)
[0110]FNIDDFVPPGGGTNKISIP陽YYR(沈QIDN0:7)
[0111]ATALTYDPYVNYSSR(沈QIDN0:8)
[0112] HTIPQPFSYHSR(SEQIDNO:9)
[011引YFTP邸VLDSTIDYFQPNNK(SEQIDN0:10)
[0114] VTMYVQFR(沈QIDN0:11)
[011 引MTTVTTPSWNVDMMR(SEQIDN0:12),
[0116]FNINDFLPPGGGSNPLTVP陽YYR(沈QIDN0:13),
[0117]ANALTYDPYVNYSSR(沈QIDN0:14),
[0118]ffllTQPFSY服R(SEQIDN0:15),
[0119]YFTPK(沈QIDN0:16),
[0120] PVLDR(沈QIDN0:17),
[0121] LQTTGNVDHVGLGTAFENSIYDQDYNIR(SEQIDNO:18),
[012引 ITMYVQFR(沈QIDN0:19),
[012引EFNLK(SEQID N0:20),
[0124] DPPLNPK(沈QIDN0:21),
[01巧]YFTPK PVLDR(沈Q ID NO:22)，
[0126]EFNLKDPPLNPK佛QIDN0:23),
[0127]VEFWPCSP口QGDR(沈QIDN0:24)，
[0128]GVGSTAVILDDNFVTK(SEQIDNO:25),
[0129] W及具有與選自SEQIDNO:4-25的氨基酸序列至少80%相同的氨基酸序列的任 何膚，其中所述膚更優選是經標記的，特別是在C-末端氨基酸殘基處，用選自肥、C13和N15 的至少一種穩定同位素標記。
[0130] 如本文所用，特別需要理解的是術語"與SEQIDN0:X的序列相同"分別等價于術 語"在SEQIDN0:X的長度上與SEQIDN0:X的序列相同"或術語"在SEQIDN0:X的完整 長度上與SEQIDN0:X的序列相同"。在此情形中，"X"是選自1-28的任意整數，因而"SEQ IDN0:X"表示了本文提到的任