意SEQIDNO。
[0131] 如本發明的情形中所述的蛋白酶優選選自由W下組成的組：膜蛋白酶、膜凝乳蛋 白酶、胃蛋白酶、凝血酶、木瓜蛋白酶、渡羅蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、因子 Xa、金黃色葡萄球菌（Staphylococ州Saureus)蛋白酶、簇膚酶A、及其組合。
[0132]另外，根據本發明另外的方面，本發明對樣品中的一或多種病毒蛋白的存在進行 定量的方法用于對病毒感染進行診斷或監測，特別是其中所述病毒感染是PCV2感染，更特 別是PCV2a和/或PCV化感染，和/或其中所述動物是豬。
[0133] 優選所述樣品特別是動物材料的樣品或動物材料制劑的樣品，其中所述動物材料 選自體液或組織。
[0134] 所述動物材料優選選自血液、血清、血漿、尿液、初乳、組織切片、和組織活檢物。
[0135] 本發明優選提供在疫苗（優選組合疫苗）中定量確定組分（優選抗原）的改良的 方法和組合物，特別是其中所述疫苗中的另一種組分干擾標準免疫測定法。具體而言，本發 明設及具有第二種疫苗的組合疫苗中第一種疫苗抗原的定量測定，其中所述第二種疫苗包 括會干擾標準免疫測定法的生物學成分，例如血清。例如，所述血清可能來自已經暴露于所 述第一種抗原的動物，由此所述血清含有干擾第一種抗原的化ISA測定的抗體。例如，豬 肺炎支原體（Mycoplasmahyopneumoniae，M.hyo)和豬圓環病毒2 (PCV2)對豬有致病性， 因而期望針對運兩種病原體進行疫苗接種。用于培養豬肺炎支原體的培養基包含豬血清。 因為大多數的豬都針對PCV2進行了免疫，用于培養豬肺炎支原體的培養基包含不同量的 抗-PCV2抗體。運些抗-PCV2抗體可干擾標準免疫測定法，所述標準免疫測定法用于對含 有治療量的PCV2抗體和豬肺炎支原體抗原的組合疫苗（在抗原組合在一起后）進行定量 或監測其穩定性。 陽13引 《巧麻臨郷I-質譜
[0137] 多反應監測-質譜（MRM-MS、或如本文所用的MRM)，與穩定同位素標記的內部標準 組合，在制藥產業中用于小分子的定量檢測。當沒有適宜的抗體對可用時MRM-MS理論上是 有用的。當需要多路組或者候選蛋白是修飾的蛋白時MRM-MS理論上也是適用的，并且可W 測量來自多種來源包括血清和組織的高濃度或低濃度的蛋白。MRM-MS也可W在一個測定中 同時測量多個目標蛋白。任選地，穩定的重同位素標記的膚通常用作內部標準。因而，盡管 在鑒別和制備適宜的參考膚方面有不確定性，但MRM-MS仍具有潛力可在制造期間和最終 加工之后用于疫苗的效價測定，可用于疫苗穩定性測試，用于參考穩定性測試（也即，穩定 性的證明），W及新的疾病生物標記物的鑒別。盡管該技術有固有的不確定性，但是在某些 應用中MRM-MS理論上可用于解決一些化ISA檢測中存在的問題。下表概括性地總結了運 兩種技術的比較。
[0138]ELISA和MRM-MS方法用于對生物治療物進行定量的比較
[0139]
ELISA測定運行時間：4~8hr [iH
[0140] 在MRM最初開發時，其對于復雜生物樣品中的蛋白定量是不適用的，因為MRM測 定法需要確定的蛋白W用于效價測定和參考穩定性監測。運個問題在幾個特定的例子中 得到了解決，其中MRM已被證明能夠對商業疫苗中S種流感亞型的血凝素抗原（HA)進 行同時的和絕對的定量。參見Williamsetal. 2008,如antificationofinfluenza virushemagglutininsincomplexmixturesusingisotopedilutiontandemmass spectrometry.Vaccines26:2510-2520。Williamsetal.通過使用MRM方法顯示了商業 疫苗中HI、冊和B的總HA量被定量為24、16和38微克/0. 5ml。然而，該流感疫苗包含部 分純化的抗原，不含有任何佐劑，并且血凝素并不懸浮于復雜基質中。因而，雖然MRM在能 夠鑒別出適宜的祀標時或許能夠對高度復雜的生物治療物的特定組分進行定量，但是許多 祀標由于各種分子相互作用而并不適于用MRM檢測，例如，含有某些佐劑的那些，W及其中 抗原處于會影響定量的競爭性抗體和/或蛋白質環境的復雜基質中的那些。
[0141] 在疫苗生產和質量控制分析中有許多可W使用MRM的應用，特別是其中不可能使 用標準化ISA測試時（如上文所述）。具體而言，如果發現疫苗和其它組分的復雜混合物中 的其它組分，不能使用ELISA，包括例如，其中的多個組分具有相似抗原性的多價疫苗，或者 含有來自可能含有干擾抗體（由于之前的感染或接種疫苗）的動物血清的疫苗。在運些情 形中，可W鑒別出特異性的膚用作"特征膚"W檢測和定量混合物中的抗原的量和性質（例 如，完整的或已降解的）。
[0142] 例如，豬圓環病毒2型（PCV2)已經被鑒別為豬多系統衰竭綜合征（PMW巧的致病 物質。開放閱讀框2(0RF2)編碼已被報道具有免疫原性的核衣殼蛋白。0RF2已被克隆至 桿狀病毒表達系統并且能夠在昆蟲細胞培養物中生長時被表達。參見例如，U.S.Patent No. 7, 910, 306 ;7, 914, 992 ;和8, 025, 888。純化的0RF2蛋白或者制備于單價疫苗基質中 的0RF2可W直接通過MRM進行測試；然而，更具體的來說，當其存在時0RF2蛋白抗原是二 價疫苗制品的一種組分，另一種組分包含另一種抗原如在含有豬血清的介質中產生的豬肺 炎支原體（Mycoplasmahyopneumoniae)。因而組合疫苗在疫苗基質中含有不同量的內源 豬血清IgG抗體（PAb)，其天然與化ISA抗體競爭結合0RF2-抗原，運繼而會干擾化ISA測 定。運些疫苗制劑可W直接作為疫苗制品進行測試，或者使用免疫沉淀（I巧措施或尺寸排 阻層析（SEC)純化技術從制品基質中提取出來。
[0143] 因而存在多種使用特征膚的措施可用于通過使用MRM來對疫苗蛋白進行檢測和 定量。運些不同的措施包括：
[0144]a.使用單一膚對例如PCV2 0RF2進行定量的多反應監測（MRM)
[0145] 此方法直接對蛋白祀標的量進行定量而無需使用抗體（Ab)。
[0146] 雖然一些蛋白可W使用LC-MS/MS，（也即，MRM-M巧技術直接進行定量分析，然而 其它蛋白，如PCV2 0RF2,則太大而不能進行直接定量分析。因此，此類蛋白可W通過多種方 式連續處理W便制備較小的膚W用于MRM分析。
[0147] 在下文中，討論了制備PCV2 0RF2樣品的一般方法，其包括W下的一般步驟：變 性、還原、烷基化和膜蛋白酶化。然而，本領域技術人員會理解可W常規地對運些制備步驟 進行變化，特別是使用不同的酶來切割蛋白。對于進行MRMW便對復雜樣品（如疫苗基質） 中蛋白的量進行定量的一般方法，討論了典型的蛋白水解酶，膜蛋白酶。
[0148] 膜蛋白酶特異性地在多膚鏈精氨酸（時或賴氨酸（K)之后的膚鍵處切割，并生成 全體的膜蛋白酶膚集合。選擇滿足W下條件的獨特的特征性膜蛋白酶膚：
[0149]a.具有獨特氨基酸序列的膚，其特異于其被切割下的PCV2 0RF2蛋白；
[0150]b.運些膚的量在化學計量上對應于其被切割下的全PCV2 0RF2蛋白的量；
[0151]C.此類膚經正電噴霧電離巧SI)很好地電離化。
[0152] 由此所產生的膚被稱為內源"特征"膚。
[0153]MRM另外還使用經同位素標記的合成膚同系物（也即，外源"特征"膚）作為內部 標準W用來對內源特征膚的豐度進行定量。通過將內源特征膚的量與已知量的相應的外源 特征同系物（也即，經同位素標記的合成膚同系物）進行比較來確定蛋白的量。合成同系 物上的重標記引起MRM中質譜的遷移，運使得可W直接地與內源特征膚進行比較。
[0154] 在樣品的膜蛋白酶消化之后，將已知量的外源"特征"膚添加至消化測定中。由于 可W通過在質譜前進行另外的分離階段來將復雜膚混合物的分析進行簡化，因而首先使膚 混合物經過反相高效液相層析0PLC)并且膚基于其疏水性而分層。該液相層析步驟的目 的是將膚向電噴霧元件的遞送散布于長的時間段，W增加可W被鑒別出來的膚的數目。
[0155] 接下來，對兩種被洗脫的分析物種類（也即內源和外源特征膚）基于通過S重四 極桿質譜的定量進行連續在線分析，所述=重四極桿質譜具有WMRM模式運行的串聯的四 極桿裝置：
[0156] 所述膚在低抑下（例如，在甲酸中）遞送至質譜儀，低抑將它們轉化為陽離子形 式。用ESI在源區域將膚分別離子化并產生帶電的分析物離子。在將膚離子遞送至質譜 時，第一階段展示出不同膜蛋白酶膚的始終變化的m/z(質荷比）讀數（MSI譜）。峰高（電 流）是各膚離子豐度的函數，但是卻受到其它物理化學性質的影響。MSI譜中的m/z信息一 般不足W鑒別出具體的膚。
[0157] 為了完成此任務，所選擇的膚會經過另一個水平的分析，該分析從選定的"親代" 膚離子的祀向片段化開始。
[015引膚片段化最常用的方法是碰撞誘導解離（CID)，其一般破壞單個膚鍵，將每個膚離 子片段化為兩段。在給定膚離子中斷裂的具體膚鍵是可變的，然而會產生許多片段。因而， CID產生互補的b-和y-型離子系列的片段。所述b-離子通過切割位點含有畑2末端；所 述y-離子通過切割位點含有C00H末端。
[0159] 質譜顯示所謂的"片段化譜"（MS2譜；底部）。此處，相鄰的b-或y-系列的峰之 間m/z的差異恰好是一個片段中存在而另一個中缺失的氨基酸的殘基質量。因而，yl-10峰 (m/z= 1，276. 4)和yl-9峰（m/z= 1，147. 4)之間的差異中恰好是谷氨酸的殘基質量巧； 129.ODa)。
[0160] 理論上，可W從MS2譜直接讀取膚序列。然而實際上，計算機使用MS2譜及親代 膚離子的m/z-起來與適宜蛋白種類的所有理論譜比較，W便鑒別膜蛋白酶膚和蛋白的來 源。從所有源自適宜的單一種類蛋白測序數據庫的氨基酸序列的計算模擬膜蛋白酶消化中 產生理論膚譜的數據庫。
[0161] 例如，豬圓環病毒2(PCV2)開放閱讀框2(0RF2)具有氨基酸序列：
[0162]MTYPRRRYRRRRHRPRSHLGQILRRRPWLVHPRHRYRWR服NGIFNT化SRTFGYTVKATTVTTPSWAV DMMRFNI孤FVPPGGGTNKISIP巧YYRIRKVKVEFWPCSP口QGDRGVGSTAVIUDNFVTKATALTYDPYVNYSS RHTIPQPFSYHSRYFTPKPVLDSTIDYFQPNNKRNQLWLRLQTSRNVDHVGLGTAFENSKYDQDYNIRVTMYVQFRE FNL邸PPLEP佛QIDN0:1)
[0163] 在其中她特的膀帝白酶化VEFWPCSPITQGDR(h沐中帶下劃線的:沈QIDNO:24) 具有比來自PCV2 0RF2的其它膚更強的信號，并且被認為是PCV2 0RF2的"特征膚"。此膚可 W用重同位素標記，例如，"C和/或1扣已知量的所述經標記的特征膚可用來加標（SP化e) PCV2(例如，INGELVAC嚴CIRCOFLEX嚴）的膜蛋白酶消化物樣品。繼而根據標準的 方案用所述已加標的樣品來運行多反應監測MS(MRM-M巧（參見下文）。
[0164] 在第一個四極桿中怕1)，所述特征膚被選擇通過。隨后，在第二個四極桿怕2)中 從PCV2蛋白中將所述特征膚片段化。第S個四極桿怕3)中僅僅分析在Q2中生成的所選 擇的片段。結果使得可W對未標記的或者"輕"特征膚與已標記的或者"重"特征膚的比例 進行定量。此分析可W用多份已知量的標記的膚與未知的來進行重復，W生成標準曲線用 于絕對定量。通過使用重特征膚對輕特征膚的比例，可W計算初始樣品中PCV2蛋白的量。
[0165] 數據顯示在監測的MRM通道中沒有來自背景的干擾。MRM能夠基于蛋白水解膚作 為相應完整0RF2的替代的定量來對PCV2 0RF2進行定量。
[0166]b.用多種特征膚對例如完整PCV2 0RF2VLP的定量
[0167] 使用MRM，多種特征膚可用于直接對固定組合疫苗中的PCV2 0RF2蛋白進行定量， W確保PCV2 0RF2蛋白是完整的。如果一種特征膚的信號降低，那么全長0RF2被降解。特 征膚在如下0RF2序列中加了下劃線。
[0168]MTYPRRRYRRRRHRPRSHLGQILRRRPWLVHPRHRYRWR服NGIFNT化SRTFGYTVKATTVTTPSWAV DMMRFNI孤FVPPGGGTNKISIP巧YYRIRKVKVEFWPCSP口QGDRGVGSTAVIUDNFVTKATALTYDPYVNYSS RHTIPQPFSYHSRYFTPKPVLDSTIDYFQPNNKRNQLWLRLQTSRNVDHVGLGTAFENSKYD孤YNIRVTMYVQFRE 四化邸PPLEP佛QIDN0:1)
[0169] 例如，=種特征性或特征膜蛋白酶膚可在該測定中用于監測：一種作為首選膚用 于定量，而另外兩種作為次選膚用于定性確認。對于PCV2,所述膚序列，例如如下：
[0170]首選膚：VEFWPCSP口QGDR(沈QIDN0:24)
[0171]次選膚 1 :ISIP陽YYR(沈QIDN0:26)
[0172]次選膚 2:NVDHVGLGTAFENSK(沈QIDNO: 4)
[0173] 該測定也加入了針對所有S種祀膚的穩定同位素標記的內部標準（I巧（其是特 征膚），并且在分析中使用相關分析物/IS的應答比率。該內部標準/特征膚序列如下：
[0174]首選I.S.用于定量：0RF2(P1*) (VEFWPCSPITQGDR(+10Da))(沈QIDN0:24)
[017引 次選I.S.定性使用：0RF2(P2*) (ISIPFEYYR(+10Da))(SEQIDN0:26)
[0176]次選I.S.定性使用：0RF2(P3*) (NVDHVGLGTA陽NSK(+8Da))(沈QIDN0:4)
[0177] 可W通過尺寸排阻層析從疫苗樣品中提取PCV2 0RF2VLP,繼而在需要時可使用 MRM來對該VLP進行絕對定量。
[017引 C.使用IP-MRM對抗原性類似VLP(例如PCV2a和PCV2b)的定量和區分
[0179] PCV2a和PCV化是抗原性相似但不相同的無包膜VLP的抗原性亞型。類似地，PCV2a 0RF2和PCV2b0RF2VLP是抗原性相似的，但在氨基酸水平并不相同。期望的PCV2 0RF2疫 苗將含有VLP的混合物，所述混合物包含PCV2a0RF2和PCV化0RF2兩種亞型。
[0180] 通常，會使用ELISA方法來確定疫苗中兩種不同的PCV2 0RF2亞型的相對抗原含 量（RAC)或相對效價（RP)。然而，能夠區分PCV2a和PCV化的內含物水平的化ISA將會需 要兩種不同的MAb(-種MAb僅與PCV2a反應，而另一種MAb僅與PCV化反應）。但是，能夠 區分兩種抗原性相似的PCV2a和PCV化VLP的兩種獨特MAb的產生將會是非常困難的，也 有可能是無法實現的任務。
[0181]IP-MRM允許使用多克隆抗體來結合PCV2a和PCV2b，隨后通過MRM進行接下來的 區分W及對PCV2a和PCV2b的量進行定量。
[0182] 在IP方法中，將多克隆抗-0RF2抗體添加至疫苗樣品，使其與0RF2結合，并將所 得的0RF2-P油復合物捕獲至包被有蛋白G的磁珠上。由于0RF2對于使用LC-MS/MS技術 的直接定量分析實踐來說太大了，在標準的蛋白變性、還原、和烷基化處理步驟之后，所結 合的蛋白需要用膜蛋白酶進行"珠上"蛋白水解。此過程所產生的特征性膚片段繼而可W 作為0RF2蛋白的替代品由LC-MS/MS(液相層析多反應監測質譜，或MRM)來進行定量，且具 有所需的靈敏性、特異性、W及精確度和準確性。
[0183]d.通過免疫親和性（I巧-MRM對例如PCV2 0RF2VLP的定量
[0184]IP-MRM加入使用針對病毒樣顆粒（VLP)、核屯、樣顆粒（CLP)、或免疫學相關蛋白 /膚的多克隆抗血清或者特異性單克隆抗體（MAb)。此方法可用于疫苗中VLP、CLP、和免 疫學相關蛋白的內含物水平的定量和/或相對效價（R巧確定。此方法使用ELISA與MRM 的組合。例如，使用標準技術，將生物素化的抗-PCV2 0RF2單克隆Ab附著至鏈霉抗生 物素蛋白包被的化ISA板。所述Ab被封閉，繼而裝載來自疫苗（例如，INGELVAC貨 CIR.COFLEX液MYCO化EX液，其包含分別針對PCV2和豬肺炎支原體的抗原）的 PCV2 0RF2,并使其結合至板上。使用標準技術，繼而從所述板釋放0RF2VLP，再注射入 LC-MRM并定量。
[0185]e.通過尺寸排阻層析（SEC)-MRM對例如PCV2 0RF2VLP的定量
[0186] 與IP-MRM方法類似但不依賴于抗體的使用，使用SEC作為預先步驟確保要測量的 樣品中僅存在VLP或內部CLP，因只有完整的VLP或CLP結構會通過而進入空隙級分（void 化action)。SEC-MRM使得可W將VLP從具有高水平的不相關、外來蛋白的復雜基質中分離。 此方法中無抗體。如果存在抗原批次含有完整VLP和降解的VLP兩者的可能，那么加入SEC 步驟可確保在測定的MRM部分僅測量完整VLP(也即，真的VLP)。
[0187] 在上述應用中，特別提到的是PCV2的0RF2的鑒別。然而，本發明的方法還可W用 于對其它疫苗（包括運些疫苗的非相似蛋白）進行檢測和定量，包括但不限于：
[0188]f.用IP-MRM對無包膜、單體PPVVP2VLP的定量
[0189] 豬細小病毒（PPV)VP2VLP可W如上文所述進行定量，用于對含有兩種抗原的疫苗 中抗原性相似但不同的VLP的抗原性亞型的量進行定量（也即，NADLPPVVLP與另一種PPV VLP，IDT27的定量區分）。在IP方法中，將單克隆或多克隆抗-PPV抗體添加至疫苗樣品， 使其結合至PPVVP2VLP，而所得到的PPVVP2VLP-抗體復合物被捕獲到包被有蛋白G的 磁力珠上。由于PPVVP2VLP對于使用LC-MS/MS技術的直接定量分析實踐來說太大了，在 標準的蛋白變性、還原、和烷基化處理步驟之后，所結合的蛋白需要用膜蛋白酶進行"珠上" 蛋白水解。
[0190] g.用IP-MRM對無包膜、二聚體VLP進行定量
[0191] 貓嵌環狀病毒（FCV)VLP(包含VPl和VP2)-如上，對抗原性相似但不同的VLP的抗 原性亞型的量進行定量（也即，FCVDD1與IFCV666的定量區分）。在IP方法中，將單克隆 或多克隆抗-FCV抗體抗體添加至疫苗樣品，使其結合至FCVVLP，而所得到的FCVVLP-抗 體復合物被捕獲到包被有蛋白G的磁珠上。由于FCVVLP對于使用LC-MS/MS技術的直接 定量分析實踐來說太大了，在標準的蛋白變性、還原、和烷基化處理步驟之后，所結合的蛋 白需要用膜蛋白酶進行"珠上"蛋白水解。
[0192] 諾如病毒（Norovirus)疫苗-對疫苗中抗原性相似但不同的VLP混合物中多個亞 型的VLP的定量。在IP方法中，將單克隆或多克隆抗-諾如病毒抗體抗體添加至疫苗樣品， 使其結合至諾如病毒VLP，而所得到的諾如病毒VLP-抗體復合物被捕獲到包被有蛋白G的 磁珠上。由于諾如病毒VLP對于使用LC-MS/MS技術的直接定量分析實踐來說太大了，在標 準的蛋白變性、還原、和烷基化處理步驟之后，所結合的蛋白需要用膜蛋白酶進行"珠上"蛋 白水解。
[0193] 輪狀病毒疫苗-對疫苗中抗原性相似但不同的VLP混合物中多個亞型的VLP定 量。在IP方法中，將單克隆或多克隆抗-輪狀病毒抗體抗體添加至疫苗樣品