，使其結合至 輪狀病毒VLP，而所得到的輪狀病毒VLP-抗體復合物被捕獲到包被有蛋白G的磁珠上。由 于輪狀病毒VLP對于使用LC-MS/MS技術的直接定量分析實踐來說太大了，在標準的蛋白變 性、還原、和烷基化處理步驟之后，所結合的蛋白需要用膜蛋白酶進行"珠上"蛋白水解。
[0194]h.用IP-MRM或SEC-MRM對非包殼的、多聚VLP進行定量
[0195] 藍舌病毒度TV)VLP包含VP3和VP7制成的內部核屯、樣顆粒（CLP)、W及VP2和VP5 的外部衣殼。重要的是，CLP在疫苗接種的動物內并不誘導中和抗體。完整VLP是優選的 抗原形式，因為中和抗體是針對構成VLP外層的VP2和VP5。全世界分布有至少24種血清 型的BTV，而最佳的BTVVLP疫苗會含有許多不同血清型的VLP。
[0196]SEC-MRM或IP-MRM可用于對具有許多BTVVLP的混合物的多價疫苗中的抗原水平 進行定量區分。SEC會將CLP和VLP收集至空隙級分中。然而，MRM可用于測量空隙級分中 VP3、VP7、VP2和VP5的確切量，而VP3、VP7、VP2和VP5的比例可W用于確定樣品中存在的 CLP和VLP的百分比。此種區分將會是必需的W便符合監管需求并確保商業產品中適宜的 劑量（也即，相對效價）。
[0197]i.用IP-MRM對無包膜化地核屯、顆粒進行定量
[0198] 乙肝病毒（皿V)的核蛋白存在兩種結構形式。核衣殼，作為肝炎核屯、抗原 (皿cAg)，其是自組裝成顆粒的蛋白，所述顆粒包裹病毒基因組和聚合酶并且對于病毒體的 功能和成熟而言是必需的。核蛋白分泌的、非顆粒的第二種形式是前核屯、（precore)或乙 肝e抗原她eAg)。所述皿cAg和皿eAg由抗體分別識別，但是，由于其高度的氨基酸相同 性，在T細胞水平具有交叉反應性。
[0199] 化地裂解核屯、化巧Bsc)顆粒可用于在化地SC表面展示免疫原性/免疫調節性蛋 白或膚。SEC-MRM或者IP-MRM可用于對疫苗中存在的化地SC顆粒及其展示的祀標的量和 /或比例進行定量。
[0200] j.用IP-MRM對無包膜PCV2 0RF2VLP載體蛋白進行定量
[020。PCV2 0RF2VLP顆粒可W用作免疫原性/免疫調節性蛋白或膚的載體。沈C-MRM或者IP-MRM可用于對疫苗中存在的PCV2 0RF2VLP及其展示的祀標的量和/或比例進行 定量。
[020引k.用IP-MRM對基于流感病毒M的、有包膜的VLP進行定量
[0203] 流感的基質（M)蛋白可W形成有包膜的VLP結構。免疫學相關抗原如血凝素（HA) 和神經氨酸酶（腳可W經其天然的跨膜結構域錯定在VLP的包膜上。優選地，任何基于流 感VLP的疫苗都會含有若干HA和N蛋白（例如，H1或者H3和N1或者N2 ;與每年人類流感 疫苗中發現的類似）。基于M的VLP不局限于僅攜帶流感抗原，因為運些VLP可W滲雜跨膜 結構域錯定的來自其他病毒的蛋白（例如，狂犬病G糖蛋白）。SEC-MRM或者IP-MRM可用 于對病毒蛋白抗原的量進行定量。
[0204] 1.用IP-MRM對桿狀病毒-展示的抗原VLP進行定量
[0205] 免疫學相關的抗原如血凝素（HA)、神經氨酸酶（腳、或狂犬病G可W經其天然的跨 膜結構域錯定在桿狀病毒的包膜上。此種重組桿狀病毒可W是治療性疫苗的基礎。
[0206] SEC-MRM或者IP-MRM可用于對疫苗中存在的展示祀標進行定量。W及，SEC-MRM 或者IP-MRM可用于對疫苗中存在的桿狀病毒-關聯的gp64(主要的桿狀病毒包膜蛋白） 及其展示的祀標的量和/或比例進行定量。
[0207] m.用IP-MRM對基于逆轉錄病毒gag的、有包膜的VLP進行定量
[020引逆轉錄病毒的gag蛋白可形成有包膜的VLP結構。免疫學相關的抗原如血凝素 (HA)、神經氨酸酶（腳、或狂犬病G可W通過其天然跨膜結構域錯定在桿狀病毒包膜上。 SEC-MRM或者IP-MRM可用于對病毒蛋白抗原的量進行定量。
[020引 n.MRM與另外的步驟的組合，例如，預先純化和/或同時檢測另外的蛋白
[0210] 在檢測SEQIDNO: 1的PCV2 0RF2之外，本發明的方法還可用于對例如，在多價疫 苗中的所述病毒的亞型進行檢測和定量。PCV2a和PCV化是抗原性相似但不同的VLP的抗 原性亞型。類似地，PCV2a0RF2和PCV2b0RF2VLP亞型在抗原性上相似，但在氨基酸水平 并不同。期望的PCV2 0RF2疫苗會含有VLP的混合物（包含PCV2a0RF2和PCV化0RF2亞 型兩者）。
[0211] 通常，ELISA方法會用于確定疫苗中兩種不同的PCV2 0RF2亞型的相對抗原含量 (RAC)或者相對效價（RP)。然而，能夠區分內含物水平的PCV2a和PCV化的ELISA將會需 要兩種不同的MAb(-種MAb僅與PCV2a反應，而另一種MAb僅與PCV化反應）。但是，能夠 區分兩種抗原性相似的PCV2a和PCV化VLP的兩種獨特MAb的產生將會是非常困難的，也 有可能是無法實現的任務。
[0212] IP-MRM允許使用多克隆抗體來結合PCV2a和PCV2b，隨后通過MRM進行接下來的 區分W及對PCV2a和PCV2b量的定量。
[021引SEQIDN0:1是PCV2最常見亞型（也即是PCV亞型PCV2a)的全長0RF2的氨基酸 序列：
[0214]
[0215] 沈QIDN0:2和沈QIDN0:3是PCV2的0RF2b的氨基酸序列的變體：
[0216]
[0220] 粗體/下劃線的序列是各蛋白的"特征膚"。
[0221] 0.用于MRM鑒別的特征膚的鑒別
[0222] 本發明的方法依賴于能夠在其它組分的混合物中的蛋白祀標內，鑒別出對該混合 物中特定蛋白而言具有特異性的序列。
[0223] 在一個實施方案中，用軟件分析蛋白祀標的序列，W確定用各種酶所產生的膚的 序列。優選地，與期望的蛋白所存在于的組合物相比，運些膚對于所要檢測的期望的膚而言 是獨特的，并且所述膚不會太小或者太大而不適宜用作特征膚。
[0224] 雖然有運樣的指引用于選擇適宜于本發明的特征膚，但是仍然需要試驗驗證來對 特征膚的獨特性進行確認。例如，由ABIMulti如ant軟件（版本1. 0)起初提示的最有可 能在本發明中可用的=種膜蛋白酶膚中的兩種，其表現正如預期。出乎意料的是，雖然在選 擇用于初始試驗中對0RF2蛋白濃度進行定量的S種膚中，ISIPFEYYR膚（SEQIDN0:26)具 有最強的信號，但是此膚卻未能具有定量分析所需的特征，運或許是由于未預計到的由豬 血清蛋白帶來的干擾。
[0225]P.用于MRM鑒別的樣品的制備
[0226] 如果需要的話，可W使用多種樣品制備技術來在MRM分析之前純化樣品，W便增 強信號質量。運些技術包括，例如，免疫親和、免疫沉淀、和尺寸排阻層析。
[0227] 定女
[022引除非另有定義，本文所使用的所有技術和科學術語都具有本發明提交時所屬領域 內技術人員通常所理解的相同含義。術語的含義和范圍應當是清楚的；然而，當有任何潛在 的歧義時，本文提供的定義優先于任何字典或者外來的定義。另外，除非上下文另有其它需 要，否則單數術語應當涵蓋復數W及復數術語也應涵蓋單數。在本文中，使用"或"意味著 "和/或"，除非另有說明。此外，使用術語"包括"，化及其它的形式如"包含"和"含有"并 非是限制性的。
[0229]"蛋白質"沒有限制地指任何蛋白質，并且優選包括那些至少包含50個氨基酸的蛋 白質。
[0230]"膚"是指較短的多膚，并且優選包括那些包含50個或者更少氨基酸的多膚，例如 4-50個氨基酸之間，或者10-24氨基酸。
[0231]"分析物蛋白"和"分析物膚"指要進行定量的特定的蛋白或者膚。
[0232]"特征膚"包括：通過蛋白酶或化學切割片段化而從分析物蛋白或者膚制備的內源 特征膚；W及含有對應于已知的或者預測的待分析蛋白中的序列的氨基酸序列的外源或合 成膚，并且所述氨基酸序列經過標記使得所述外源特征膚與從待分析蛋白生成（經蛋白酶 或化合物片段化）的內源膚相同或者幾乎相同，而僅僅除了在分子質量方面有微小差異。 質量標記的膚內部標準的化學修飾優選是加入穩定的同位素。在運種情況中，外源特征膚 和從分析物蛋白片段化得到的內源特征膚將會是相同的，除了在分子質量方面有微小差 異。
[0233]"疫苗"是指免疫原性組合物，當其施用給動物時，會在動物體內激發或者能夠激 發（直接或間接的）針對所述組合物中抗原的有效免疫應答，例如，抗原會激發對致病性生 物體的免疫應答。優選地，此類免疫應答會減少一或多種臨床跡象（與一或多種致病性生 物體相關或者由其感所引起）的發病率或者嚴重性。
[0234]"抗原"是指如本文所述激發免疫應答的多膚或者蛋白。"免疫原性"蛋白或者多膚 包括本文鑒別的任何蛋白或者多膚的全長序列，或者其類似物或免疫原性片段。術語"免疫 原性片段"或者"免疫原性部分"是指抗原性或者免疫原性蛋白或者多膚的片段或者截短的 或經取代的形式，其包括一或多個表位并因而會激發本文所述的免疫學應答。一般而言，此 類截短的和/或經取代的形式、或者片段將包含來自全長蛋白的至少六個連續的氨基酸。 更優選地，所述截短的和/或經取代的形式、或者片段將包含來自全長蛋白的至少10個、更 優選15個、更優選19個連續的氨基酸。
[0235]"免疫應答"或者"免疫學應答"是指（但不限于），細胞和/或抗體介導的針對感 興趣的組合物或疫苗的免疫應答的發展。通常，免疫或者免疫學應答包括但不限于，一或多 種W下效應：抗體、B細胞、輔助T細胞、抑制性T細胞、和/或細胞毒T細胞的產生或激活， 其特異性的針對感興趣的組合物或疫苗中所包括的抗原或者多個抗原。優選地，宿主將會 展現出治療性或者保護性免疫學（記憶）應答，從而增強對新感染的抗性和/或降低疾病 的臨床嚴重性。此種防護將會得到W下證明：癥狀數目的減少、癥狀嚴重性的降低、或者與 病原體感染相關聯的一或多種癥狀的消失、病毒血癥發作的延緩、病毒持續性的降低、整體 病毒載荷的降低和/或病毒排出（excretion)的減少。
[0236]"藥學-或獸醫學-可接受的載體"是指任意的W及所有的溶劑、分散介質、包被、 佐劑、穩定劑、稀釋劑、防腐劑、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲劑、吸收延緩劑等。在一些優選的 實施方案中，特別是包括凍干的免疫原性組合物的那些實施方案中，本發明所使用的穩定 劑包括用于凍干Qyo地ilization)或者冷凍干燥（化eeze-^^ng)的穩定劑。
[0237]"佐劑"如本文所用，可包括氨氧化侶和憐酸侶，皂巧類例如，如ilA， QS-21(CambridgeBiotechInc.，CambridgeMA)、GPI-0100(GalenicaPharmaceuticals， Inc.，Birmin曲am,AL)、油包水乳劑、水包油乳劑、油包水乳劑。所述乳劑可W具體而言是 基于輕液態石蠟（歐洲藥典型）；類異戊二締油如整締或者S十碳六締；得自締控（特別 是異下締或者癸締）寡聚化的油；含有線性控基的酸或者醇的醋，更特別是植物油、油酸乙 醋、丙二醇二-(辛酸醋/癸酸醋）、甘油基=-(辛酸醋/癸酸醋）或者丙二醇二油酸醋； 分支脂肪酸或者醇的醋，特別是異硬脂酸醋。將油與乳化劑組合使用W形成乳劑。所述乳 化劑優選非離子型表面活性劑，特別是山梨聚糖的醋、二縮甘露醇的醋（例如脫水甘露醇 油酸醋）、乙二醇的醋、聚丙S醇的醋、丙二醇的醋，W及油酸、異硬脂酸、藍麻油酸或者徑 硬脂酸的醋，其任選是經乙氧基化的，和聚氧丙締聚氧乙締共聚物嵌段，特別是Pluronic 產物，尤其是L121。參見Hunteretal.,HieHieoiTandPracticalApplicationof Adjuvants巧d.Stewart-l'ulLD.E.S.),JohnWileyandSons,NY,pp51_94(199f5)和Todd etal.，Vaccine15:564-570(1997)。示例性佐劑有M.化well和M.化wman編輯的"Vaccine Design,TheSubunitandAdjuvantApproach",PlenumPress, 1995 中第 147 頁中描述的 SPT乳劑，W及同樣是運本書的笛183頁所描述的乳劑MF59。
[023引佐劑的另外的例子有選自W下的化合物：丙締酸或者甲基丙締酸的聚合物W及 順下締二酸酢和烷基衍生物的共聚物。有利的佐劑化合物有交聯的丙締酸或者甲基丙締 酸的聚合物，特別是用糖或聚醇的聚苯酸。運些化合物已知稱為術語卡波姆（carbomer) (化armeuropaVol. 8,No. 2，June1996)。本領域技術人員也可參閱U.S.Patent No. 2, 909, 462其中描述了此類丙締酸聚合物交聯了多徑基化的化合物（具有至少3個徑 基），優選不超過8個，至少3個徑基的氨原子被不飽和脂肪控自由基（具有至少2個碳原 子）置換。優選的自由基是含有2-4個碳原子的那些，例如乙締基、締丙基和其它締控不飽 和基團。所述不飽和自由基其本身可化含有其它取代，如甲基。W商品名Carbopol出售的 產品；（BFGoo化ich，Ohio,USA)是特別適宜的。它們與薦糖交聯Hieyarecross-linked withanallylsucrose或者與締丙基季戊四醇交聯。其中，可能提到的有Carbopol974P、 934P和971P。最優選的是使用Carbopol971P。在順下締二酸酢和烷基衍生物的共聚物 中，是EMA共聚物（Monsanto),其是順下締二酸酢和乙締的共聚物。運些聚合物在水中的溶 解導致酸性溶液，其將會被中和，優選中和至生理pH，W便提供免疫原性、免疫學或疫苗組 合物本身將要加入的佐劑溶液。
[0239] 另外的適宜的佐劑包括但不限于，RIBI佐劑體系巧ibiInc. )、Block共聚物 (切tRx，AtlantaGA)、SAF-M(Qii;ron，血eryvilleCA)、單憐酷基脂質A、Av;ridine脂質-胺 佐劑、來自大腸桿菌（重組的或者不是）的不耐熱腸毒素、霍亂毒素、IMS1314或者胞壁酷 二膚、或者自然發生的或重組的細胞因子或其類似物或者內源細胞因子釋放的刺激物，等 等。
[0240]"稀釋劑"可包括水、鹽水、葡聚糖、乙醇、甘油等。等滲劑可包括氯化鋼、葡聚糖、甘 露醇、山梨醇、和乳糖等。穩定劑包括白蛋白和乙二胺四乙酸的堿金屬鹽等。
[0241]"疫苗基質"或者"制劑基質"或者"背景基質"全都是指佐劑、賦形劑、稀釋劑、等 滲劑、穩定劑或者配制為向動物注射的疫苗中的其它材料（除特定的抗原之外）。運些材料 可化含有干擾對組合疫苗中第二種疫苗抗原的檢測和/或準確定量（使用常規測定法）的 元素，例如，由于存在來自制備疫苗組分時所使用的血清的抗體，或者與第二種疫苗抗原競 爭結合化ISA免疫測定中所使用的抗體的其它材料。 陽24引用于鑒別巧合成特佈化的方法
[024引用于鑒別和合成特征膚的一般方法是本領域已知的，例如，如W0200600281中所 描述的，其公開內容援引加入本文。
[0244] 本發明提供了使用質量標記的特征膚來定量測量膚的方法，其中所述膚產生自復 雜混合物中的疫苗的完整蛋白，所述混合物含有干擾特異性結合配偶體元素如基于抗體的 ELISA測定，其中所述膚產生自酶或者化學切割。所述質量標記的特征膚含有與通過此類切 割產生的分析物疫苗蛋白片段相同的或者幾乎相同的氨基酸序列。分析物疫苗蛋白的切割 產生了來自蛋白的可分析的膚，其中從分析的角度來說，所述可分析的膚和質量標記的特 征膚之間唯一的區別在于通常2-10道爾頓的質量遷移（mass-shift)。
[0245] 通過使用質量遷移的特征膚，實現了W下優勢：i)內部標準前體可W設計為，在 蛋白片段化之前進行的任何各種任選的樣品制備步驟期間，與分析物蛋白或者分析物膚一 起共純化；和ii)單一的內部標準前體可W設計為生成內部標準膚W用于分析源于若干不 同的分析物蛋白或者分析物膚的膚片段。
[0246] 質量標記的特征膚可W通過膚合成來生成，期間滲入一個或多個質量標記的氨基 酸。優選地，質量標記氨基酸含有一個或多個穩定同位素，包括但不限于"C、l5N、lSo、2H、和 34s。
[0247] 可W通過固相膚合成的Fmoc-聚酷胺模式來合成膚，如Luetal.，（1981)J.化g. 化em. 46, 3433(化及其中的參考文獻）中所描述的。臨時的N-氨基基團保護是通過9-巧 甲氧幾基（Fmoc)基團提供的。此種高度堿不穩定的保護基團的重復切割是用N5N-二甲基 甲酯胺中20%的贓晚來實現的。側鏈功能性可W保護為其下基酸（對于絲氨酸、蘇氨酸和 酪氨酸的情況）、下基醋（對于谷氨酸和天冬氨酸的情況）、叔下氧徑基衍生物（對于賴氨 酸和組氨酸的情況）、S苯甲游基衍生物（對于半脫氨酸的情況）和4-甲氧基-2, 3, 6-S 甲基苯橫酷基衍生物（對于精氨酸的情況）。當谷氨酷胺或者天冬酷胺是C-末端殘基時， 使用4, 4' -二乙氧基二苯甲基基團來保護側鏈的酷胺基功能性。固相支持物是基于聚二甲 基丙締酷胺聚合物（由=個單體二甲基丙締酷胺（骨架單體）構成），雙丙締酷乙締基二胺 (交聯劑）和丙締酷肌氨酸甲基醋（官能化劑）。所使用的膚-至-樹脂可切割連接劑是酸 不穩定的4-徑甲基-苯氧基乙酸衍生物。所有的氨基酸衍生物被添加為其實行的對稱酸 酢衍生物，只有天冬酷胺和谷氨酷胺除外，運兩者是使用反向的N，N-二環己基-碳二亞胺 /I-徑基苯并=挫介導的偶合過程來添加的。所有的偶聯和脫保護反應是使用巧=酬、=硝 基苯橫酸或者說紅（isotin)測試過程來監測的。在合成完成時，通過95%=氣乙酸（含 有50%清除劑混合配料）處理的伴隨去除側鏈保護基團從而將膚從樹脂支持物上切割下 來。常用的清除劑有乙二硫醇、苯酪、苯甲酸和水，確切的選擇取決于要所合成的膚的構成 氨基酸。S氣乙酸通過在真空中揮發而去除，隨后用二乙酸研制（trituration)而提供粗 膚。可通過簡單的提取過程去除任何存在的清除劑，所述提取過程在水相的凍干上提供沒 有清除劑的粗膚。膚合成的試劑通常可得自化化iochem-Nov油iochem(UK)Ltd,Nottin曲am NG7 2QJ，UK。純化可W通過一種技術或者技術的組合來實現，如尺寸排阻層析、離子交換層 析和（主要是）反相高效液相層析。膚的分析可W使用薄層層析、反相高效液相層析、酸水 解之后的氨基酸分析和通過快原子轟擊（FAB)質譜分析來進行。
[024引質量標記還可W包含氨基酸的其它化學修飾，包括但不限于，乙酷化、甲基化、脫 酷胺和簇甲基化。如果質量標記修飾是加入穩定同位素之外的其它修飾，重要的是要避免 可能會改變樣品制備、分離和離子化期間內部標準膚行為的修飾。
[0249] 另外，所述質量標記的特征膚可W被合成為相對于分析物蛋白或者膚具有一或多 個取代的氨基酸殘基；例如，丙氨酸取代甘氨酸。在運種情況下，分析物蛋白或者膚和質量 標記的膚內部標準前體的切割將會從蛋白產生可分析的膚W及從內部標準前體產生內部 標準膚，從分析的角度來說它們之間唯一的差別在于，由于膚內部標準中存在的丙氨酸相 對于分析物蛋白或者膚中存在的甘氨酸而導致的質量遷移。本發明此種實施方案的優點在 于，在質量標記的膚內部標準前體的合成期間，用甘氨酸取代丙氨酸比起用同位素標記的 丙氨酸更容易。其它適宜的氨基酸取代是本領域技術人員很容易想到的，例如鄉氨酸和異 亮氨酸可W互相替換。
[0250] 所述質量標記的膚內部標準前體相對于所述分析物蛋白或膚可具有零個、一個、 兩個、=個、四個或者五個取代的氨基酸殘基，或者可W相對于所述分析物蛋白或者膚在氨 基酸殘基總數目的5%、10%、15%、20%或25%中有差異。優選所述質量標記的特征膚