前述肽脈沖的對照靶細胞顯示 低細胞毒性，這闡明了肽特異性CTL的誘導。結果表明，與不同佐劑組合的本發明的水性液 體組合物激活癌抗原特異性CTL的誘導。
[0107] [水性液體組合物的制備]
[實施例39-44]、[比較實施例24] 按表20中的量，將作為肽的是肽（A)的肽（1)、作為賦形劑是賦形劑（C)的酒石酸和 作為賦形劑（E)的甲硫氨酸溶于注射用水中，用鹽酸或/和氫氧化鈉調節至表20所述pH。 將混合物通過0.2 μπι無菌濾器過濾，以I mL裝入玻璃小瓶，將小瓶用丁基橡膠塞密封，藉 此得到水性液體組合物62-68。
[0108] [表 20] CN 105142656 A 兄明十ι 21/24 頁
[實驗實施例6]穩定性評價（5) 將制備的水性液體組合物在40°C下的培養箱中貯存1個月。然后，根據下列方法測量 肽（1)的含量（下文稱為肽含量）。
[0109] 使用C18反相柱（4. 6 mm X 150 mm，3. 5 μ m)，使用用于流動相的純水、乙腈、甲 醇和三氟乙酸，通過反相系統高效液相色譜法測量肽含量。作為肽（1)，注入相當于10 μ g 的量，在220 nm的波長下進行分光鏡檢測。利用通過該方法測量的峰面積，肽含量（%)通 過下式計算。
[0110] 肽含量（%)=肽（1)的峰面積/含有相關物質的肽的總峰面積X 100 以相同方式測量貯存前（起始）的肽含量（%)，肽的殘留比率（%)通過下式計算。
[0111] 肽的殘留比率（%)=貯存后的肽含量（%)/肽含量（起始）（%) X 100 在實施例和比較實施例中得到的水性液體組合物中，表20中描述的實施例39-44和表 20中描述的比較實施例24在40 °C下貯存1個月。肽的殘留比率（%)見表21.
[表 21]
如表21所示，當pH在3-6的范圍內時，獲得具有高穩定性、殘留比率不小于97%的水 性液體組合物。另一方面，當PH為7. 1時，肽的殘留比率降低。
[0112] [實驗實施例7]穩定性評價（6) 將制備的水性液體組合物在40°C下的培養箱中貯存4周。按與穩定性評價（1)中相同 的方式測量貯存后氧化肽的含量。
[0113] 在實施例和比較實施例中得到的水性液體組合物中，將表8中所述實施例34和表 13所述的比較實施例15、16在40°C下貯存4周。在貯存后氧化肽的含量示于表22。通過 下式計算表中氧化產物的抑制比率。
[0114] 氧化產物的抑制比率（%) = {(對照樣品（比較實施例15)的氧化肽的含量）_(表 8中實施例34或表13中比較實施例16的氧化肽含量）} X KKV (對照樣品（比較實施例 15)的氧化肽的含量） 氧化產物抑制比率的較高數值意指對氧化較高的抑制作用和賦形劑對肽（1)的高穩 定作用。
[0115] [表 22]
如表22所示，可以證實，甚至當水性液體組合物的肽濃度低時，本發明的賦形劑顯示 對氧化的抑制作用。
[0116] [水性液體組合物的制備]
[實施例45]、[比較實施例25] 按與實施例1相同的方式，制備按表23所述的量，裝入小瓶中，將小瓶用丁基橡膠塞密 封，藉此得到水性液體組合物69和70。
[0117] [表 23]
[實驗實施例8]穩定性評價（7) 將100 yL的0. 3% H2O2水加入I mL制備的水性液體組合物中。在輕輕攪拌混合物 后，立即測量氧化肽的含量，所述氧化肽是起因于甲硫氨酸殘基氧化的肽。通過類似于穩定 性評價（1)的方法，測量氧化肽的含量。
[0118] 在實施例和比較實施例中得到的水性液體組合物中，在將100 μ L的0. 3% H2O2加 入I mL的以下每個中后的氧化肽的含量（%)見表24 :表13所述比較實施例17、18,表23 所述實施例45和比較實施例25,和表8所述實施例35。通過下式計算表中氧化產物的抑 制比率。
[0119] 氧化產物的抑制比率（%) = {(對照樣品（比較實施例17)的氧化肽的含量）_(表 13、表23或表8中實施例或比較實施例的氧化肽的含量）} X KKV (對照樣品（比較實施例 17)的氧化肽的含量） 氧化產物抑制比率的較高數值意指對氧化較高的抑制作用和賦形劑對肽（1)的高穩 定作用。
[0120] [表 24]
如表24所示，可以證實，甚至當水性液體組合物的肽濃度高時，本發明的賦形劑顯示 對氧化的抑制作用。
[0121] [實驗實施例9]穩定性評價（8) 在制備的水性液體組合物中，將100 μ L 0.3% H2O2水加入I mL表14所述比較實施例 20和表9所述實施例36、37和38的各水性液體組合物中。在輕輕攪拌混合物后，立即測量 氧化肽的含量，所述氧化肽是起因于甲硫氨酸殘基氧化的肽。通過類似于穩定性評價（1) 的方法測量氧化肽的含量。
[0122] 在實施例和比較實施例中得到的水性液體組合物中，在將100 μ L 0. 3% H2O2加入 I mL表14所述比較實施例20和表9所述實施例36、37和38的每個中之后的氧化肽的含 量（%)見表25。通過下式計算表中氧化產物的抑制比率。
[0123] 氧化產物的抑制比率（%) = {(對照樣品（比較實施例20)中氧化肽的含量）_(表 9中實施例的氧化肽的含量）} X KKV(對照樣品（比較實施例20)中氧化肽的含量） 氧化產物抑制比率的較高數值意指對氧化較高的抑制作用和賦形劑對肽（1)的高穩 定作用。
[0124] [表 25]
如表25所示，可以證實，實施例36、37和38的水性液體組合物顯示對氧化的抑制作 用，其被證實在實驗實施例5中顯示CTL誘導活性。
[0125] 工業實用性 按照本發明，可提供包含來源于WTl蛋白的癌抗原肽的高穩定的水性液體組合物，可 按照使用目的，容易地將肽與不同的佐劑混合。
【主權項】
1. 一種水性液體組合物，其包含肽和賦形劑，并具有3-6的pH : 其中 所述肽選自下列（A)和（B)， (A) 由 Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu (SEQ ID NO: 1)所不氨基酸序列組 成的肽，和 (B) 由缺失、取代和/或添加1-3個氨基酸的SEQ IDNO: 1所示氨基酸序列組成并具 有細胞毒性T細胞誘導能力的肽；和 所述賦形劑包含選自下列（C)、（D)和（E)的一種或多種， (C) 選自乙醇酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸及其藥理學上可接受的鹽的一種或多 種的a羥酸， (D) 選自丙二酸、琥珀酸、戊二酸、馬來酸及其藥理學上可接受的鹽的一種或多種的二 羧酸，和 (E) 甲硫氨酸。2. 權利要求1的水性液體組合物，其中所述肽由（A) Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro -Tyr-Leu (SEQ ID NO: 1)所示氨基酸序列組成。3. 權利要求1或2的水性液體組合物，其中所述賦形劑包含（C)和（E)兩者。4. 權利要求1-3中任一項的水性液體組合物，其中所述賦形劑包含（C)和（E)兩者， 且（C)是選自乙醇酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸及其藥理學上可接受的鹽的一種或多種的a羥 酸。5. 權利要求1或2的水性液體組合物，其中所述賦形劑包含⑶和（E)兩者。6. 權利要求1、2或5的水性液體組合物，其中所述賦形劑包含⑶和（E)兩者，且（D) 是選自琥珀酸及其藥理學上可接受的鹽的一種或多種的二羧酸。7. 權利要求1-6中任一項的水性液體組合物，其中每體積a羥酸的含量為1-100 mM 或每體積二羧酸的含量為10-100 mM。8. 權利要求1-6中任一項的水性液體組合物，其中每體積甲硫氨酸的含量為1-300 mM〇9. 一種通過加入賦形劑改進水性液體組合物中的肽穩定性的方法，所述肽由Arg-Met -Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu (SEQ ID NO: 1)所不氨基酸序列組成： 其中 所述賦形劑包含選自下列（C)、（D)和（E)的一種或多種， (C) 選自乙醇酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸及其藥理學上可接受的鹽的一種或多 種的a羥酸， (D) 選自丙二酸、琥珀酸、戊二酸、馬來酸及其藥理學上可接受的鹽的一種或多種的二 羧酸，和 (E) 甲硫氨酸。
【專利摘要】本發明涉及一種包含來源于WT1蛋白的癌抗原肽和添加劑并具有3-6的pH值的水性液體組合物，其中所述肽被穩定。在所述水性液體組合物中，所述肽選自下列(A)和(B)：(A)包含Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu(SEQ？ID？NO:？1)所示氨基酸序列的肽，和(B)具有通過缺失、取代和/或添加1-3個氨基酸而來源于SEQ？ID？NO:？1所示氨基酸序列的氨基酸序列并能夠誘導細胞毒性T細胞的肽；且所述添加劑為選自下列(C)、(D)和(E)的一種或多種：(C)乙醇酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸及其藥理學上可接受的鹽，(D)丙二酸、琥珀酸、戊二酸、馬來酸及其藥理學上可接受的鹽，和(E)甲硫氨酸。
【IPC分類】A61K38/00, C07K14/82, A61P35/00, C07K7/06
【公開號】CN105142656
【申請號】CN201480014590
【發明人】中谷朋美, 齋藤晃一
【申請人】大日本住友制藥株式會社
【公開日】2015年12月9日
【申請日】2014年3月11日
【公告號】CA2905588A1, US20140271693, WO2014142102A1