水性液體組合物的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于癌癥免疫療法領域，并涉及包含具有細胞毒性T細胞誘導活性的來源 于WTl蛋白的癌抗原肽的水性液體組合物，并涉及藥物被該組合物穩定。
【背景技術】
[0002] -般而言，來源于WTl蛋白的癌抗原肽是來源于由449個氨基酸組成的人WTl蛋 白（SEQ ID NO: 2)的部分肽，具體地講是由8-12氨基酸組成的肽或其二聚體。它被呈遞為 主要組織相容性復合體（MHC) I類抗原，包括由細胞毒性T細胞（細胞毒性T-淋巴細胞， 下文稱為CTL)進行抗原識別的肽。人中的MHC稱為人白細胞抗原（HLA)。
[0003] 在來源于WTl蛋白的部分肽中，由9個氨基酸組成并以WTl126 134肽Arg-Met-Phe -Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu (SEQ ID NO: 1)的序列顯示的部分肽和其中部分氨基酸被修 飾的修飾肽（修飾肽）被報導為可用作與HLA結合誘導CTL的肽（參見專利文件1-3,非專 利文件1)。
[0004] -般用于癌癥疫苗的癌抗原蛋白質和癌抗原肽，在許多情況下與佐劑（免疫強化 劑）一起給予以更有效地誘導CTL。
[0005] 然而，常常難以維持包含這些蛋白質和肽的制劑的穩定性，特別是水中的穩定性。 因此，一般選擇通過冷凍干燥除去水的制劑。然而，從生產和成本的方面來看，冷凍干燥的 制劑是不利的，且在用時還需要例如加入水等的操作。
[0006] 由此看來，根據使用目的，開發能夠容易地將癌抗原蛋白質或癌抗原肽與各種佐 劑組合的穩定的水性液體組合物是重要的。
[0007] 至于液體的穩定，公開了含有檸檬酸或甲硫氨酸作為促性腺激素的穩定劑的冷凍 干燥的制劑（參見專利文件4)、含有甲硫氨酸作為G-CSF的穩定劑的制劑（參見專利文件 5)和pH 4或更低且含有琥珀酸或酒石酸作為G-CSF的穩定劑的制劑（參見專利文件6)。
[0008] 此外，公開了在溶液中含有以下作為修飾因子VIII多肽的穩定劑的制劑：（1) pH 調節劑以落入約4. 0-約8. 0的范圍內，（2)抗氧化劑，和（3)鈣鹽、鎂鹽（參見專利文件7)。 另外，公開了含有生理活性藥物、甲硫氨酸和新的紅細胞發生刺激蛋白、且具有改進的穩定 性的制劑（參見專利文件8)。
[0009] 然而，本發明所涉及的含有具有SEQ ID NO: 1所示序列的部分肽或其修飾肽的穩 定的水性液體組合物是未知的。
[0010] 文獻列表 專利文獻 專利文件I :W000/06602 專利文件2 :W000/18795 專利文件 3 :W02009/072610 專利文件 4 :JP-A-H10-203997 專利文件 5 :JP-A-2000-247903 專利文件 6 :W02005/39620 專利文件7 :W003/55511 專利文件8 :W003/20299 非專利文獻 非專利文件I =EP-B-1127068的審查中的書面意見。
[0011] 發明概述 發明要解決的問題 本發明的問題是提供提高具有SEQ ID NO: 1所示序列的部分肽或所述肽的修飾肽的 穩定性的水性液體組合物，其可用于制備包含上述肽的癌癥疫苗制劑。
[0012] 解決問題的方法 本發明人進行了大量研究以試圖解決上述問題，并且發現，包含具有SEQ ID NO: 1所 示序列的部分肽或所述肽的修飾肽（下文有時簡稱為本發明的肽）的水性液體組合物的主 要降解產物起因于肽中所含的甲硫氨酸殘基的氧化。此外，他們發現，所述肽的甲硫氨酸殘 基的氧化通過加入特定的賦形劑作為穩定劑而被抑制，并且通過調節組合物以具有特定的 PH獲得在制劑穩定性方面優異的水性液體組合物，這導致了本發明的完成。
[0013] 因此，本發明涉及以下方面。
[0014] 第1項.一種水性液體組合物，其包含肽和賦形劑，并具有3-6的pH : 其中 所述肽選自下列（A)和（B)， (A) 由 Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu (SEQ ID NO: 1)所不氨基酸序列組 成的肽，和 (B) 由缺失、取代和/或添加1-3個氨基酸的SEQ IDN0: 1所示氨基酸序列組成并具 有細胞毒性T細胞誘導能力的肽；和 賦形劑包含選自下列（C)、（D)和（E)的一種或多種， (C) 選自乙醇酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸及其藥理學上可接受的鹽的一種或多 種的α羥酸， (D) 選自丙二酸、琥珀酸、戊二酸、馬來酸及其藥理學上可接受的鹽的一種或多種的二 羧酸，和 (E) 甲硫氨酸。
[0015] 第2項.第1項的水性液體組合物，其中所述賦形劑包含選自下列（C)、⑶和（E) 的一種或多種： (C) 選自乙醇酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸及其藥理學上可接受的鹽的一種或多種的α 羥酸， (D) 選自琥珀酸、馬來酸及其藥理學上可接受的鹽的一種或多種的二羧酸，和 (E) 甲硫氨酸。
[0016] 第3項.第1或2項的水性液體組合物，其中（B)為Phe-Met-Phe-Pro-Asn-A la-Pro-Tyr-Leu (FMFPNAPYL) (SEQ ID NO: 3)、 Arg-Met-Met-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-L eu (RMMPNAPYL) (SEQ ID NO: 4)、Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Val (RMFPNAPYV) (SEQ ID NO: 5) ^ Tyr-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu (YMFPNAPYL) (SEQ ID NO: 6) 或 Ala-Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu (ARMFPNAPYL) (SEQ ID NO: 7)〇
[0017] 第4項·第I或2項的水性液體組合物，其中所述肽由（A) Arg-Met-Phe-Pro-As n-Ala-Pro-Tyr-Leu (SEQ ID NO: 1)所示氨基酸序列組成。
[0018] 第5項.第1-4項中任一項的水性液體組合物，其中所述賦形劑包含（C)和（E) 兩者。
[0019] 第6項.第1-5項中任一項的水性液體組合物，其中所述賦形劑包含（C)和（E) 兩者，且（C)是選自乙醇酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸及其藥理學上可接受的鹽的一種或多種 的α羥酸。
[0020] 第7項.第1-6項中任一項的水性液體組合物，其中所述賦形劑包含（C)和（E) 兩者，且（C)是選自乙醇酸及其藥理學上可接受的鹽的一種或多種的α羥酸。
[0021] 第8項.第1-6項中任一項的水性液體組合物，其中所述賦形劑包含（C)和（E) 兩者，且（C)是選自乳酸及其藥理學上可接受的鹽的一種或多種的α羥酸。
[0022] 第9項.第1-6項中任一項的水性液體組合物，其中所述賦形劑包含（C)和（E) 兩者，且（C)是選自蘋果酸及其藥理學上可接受的鹽的一種或多種的α羥酸。
[0023] 第10項.第1-6項中任一項的水性液體組合物，其中所述賦形劑包含（C)和（E) 兩者，且（C)是選自酒石酸及其藥理學上可接受的鹽的一種或多種的α羥酸。
[0024] 第11項.第1-4項中任一項的水性液體組合物，其中所述賦形劑包含⑶和（E) 兩者。
[0025] 第12項.第1、2、3、4或11項的水性液體組合物，其中所述賦形劑包含⑶和（E) 兩者，且（D)是選自琥珀酸及其藥理學上可接受的鹽的一種或多種的二羧酸。
[0026] 第13項.第1、2、3、4或11項的水性液體組合物，其中所述賦形劑包含⑶和（E) 兩者，且（D)是選自馬來酸及其藥理學上可接受的鹽的一種或多種的二羧酸。
[0027] 第14項.第1-4項中任一項的水性液體組合物，其中所述賦形劑包含（C)、⑶和 (E)的全部。
[0028] 第15項.第1、2、3、4或14項的水性液體組合物，其中所述賦形劑包含（C)、（D) 和（E)的全部，（C)是選自乙醇酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸及其藥理學上可接受的鹽的一種或 多種的α羥酸，且（D)是選自琥珀酸、馬來酸及其藥理學上可接受的鹽的一種或多種的二 羧酸。
[0029] 第16項.第1-15項中任一項的水性液體組合物，其中每體積α羥酸的含量為 1-100 mM或每體積二羧酸的含量為10-100 mM。
[0030] 第17項.第1-16項中任一項的水性液體組合物，其中每體積甲硫氨酸的含量為 1-300 HiM0
[0031] 第18項.第1-17項中任一項的水性液體組合物，其具有4-5的pH。
[0032] 第19項.一種通過加入賦形劑提高水性液體組合物中肽的穩定性的方法： 其中 所述肽選自下列（A)和（B)， (A) 由 Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu (SEQ ID NO: 1)所不氨基酸序列組 成的肽，和 (B) 由缺失、取代和/或添加1-3個氨基酸的SEQ IDN0: 1所示氨基酸序列組成并具 有細胞毒性T細胞誘導能力的肽；和 所述賦形劑包含選自下列（C)、（D)和（E)的一種或多種， (C) 選自乙醇酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸及其藥理學上可接受的鹽的一種或多 種的α羥酸， (D) 選自丙二酸、琥珀酸、戊二酸、馬來酸及其藥理學上可接受的鹽的一種或多種的二 羧酸，和 (E) 甲硫氨酸。
[0033] 第20項.第19項的方法，其中所述賦形劑包含選自下列（C)、⑶和（E)的一種 或多種： (C) 選自乙醇酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸及其