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[實驗實施例1]穩定性評價（I) 將制備的水性液體組合物貯存在60°C下的培養箱中2周。然后，根據下列方法測量氧 化肽的含量，所述氧化肽是起因于肽（1)中所含的甲硫氨酸殘基氧化的肽。
[0080] 使用用于流動相的純水、乙腈、甲醇和三氟乙酸，使用C18反相柱（4.6 mm X 150 mm，3. 5 μπι)，通過反相系統高效液相色譜法測量氧化肽的含量。作為肽（1)，注入相當于 10 μ g的量，在220 nm的波長下進行分光鏡檢測。利用通過該方法測量的峰面積，通過下 式計算氧化肽的含量（%)。
[0081] 氧化肽的含量（%)=氧化肽的峰面積/包含相關物質的肽的總峰面積X 100 在實施例和比較實施例獲得的水性液體組合物中，將表1-6描述的實施例1-22和表 10-12描述的比較實施例1-14貯存在60°C下2周。貯存后氧化肽的含量見表15和16。通 過下式計算表中氧化產物的抑制比率。
[0082] 氧化產物的抑制比率（%) = {(對照樣品（比較實施例1)中氧化肽的含量）-(表15 或表16中實施例或比較實施例中的氧化肽的含量）} X l〇(V(對照樣品（比較實施例1)中 氧化肽的含量） 氧化產物抑制比率的較高數值意指對氧化較高的抑制作用和賦形劑對肽（1)的高穩 定作用。
[0083] [表 15] CN 105142656 A 說明書 15/24 頁
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作為比較實施例，通過加入一般的酸或氨基酸作為賦形劑，來評價對肽（1)氧化的抑 制作用。結果，賦形劑對氧化幾乎沒有抑制作用（小于10%)或氧化肽含量有所增加。相比 之下，當在本發明中加入賦形劑時，總是發現對氧化的抑制作用。按照表15,證實了對氧化 的抑制作用幾乎不受本發明的賦形劑的每體積含量的影響。
[0084] [實驗實施例2]穩定性評價（2) 將制備的水性液體組合物貯存在60°C下的培養箱中2周。然后，以與穩定性評價（1) 相同的方式測量氧化肽的含量，所述氧化肽是起因于甲硫氨酸殘基氧化的肽。
[0085] 在實施例和比較實施例中得到的水性液體組合物中，將表6和7中描述的實施例 23-27和表10中描述的比較實施例1貯存在60°C下2周。在貯存后氧化肽的含量見表17。 以與穩定性評價（1)相同的方式，計算表中氧化產物的抑制比率。
[0086] [表 17]
按照表17,可以證實，在本發明中使用兩種或更多種賦形劑的組合，得到與對照相比對 氧化較高的抑制作用。
[0087] [實驗實施例3]穩定性評價（3) 將制備的水性液體組合物貯存在60°C下的培養箱中2周。然后，按與穩定性評價（1) 中相同的方式測量氧化肽的含量，所述氧化肽是起因于甲硫氨酸殘基氧化的肽。
[0088] 在實施例和比較實施例中得到的水性液體組合物中，將表14中描述的比較實施 例19和表9中描述的實施例37貯存在60°C下2周。在貯存后氧化肽的含量見表18。通 過下式計算表中氧化產物的抑制比率。
[0089] 氧化產物的抑制比率（%) = {(對照樣品（比較實施例19)中氧化肽的含量）_(表 18中實施例37的氧化肽的含量）} X 10(V (對照樣品（比較實施例19)中氧化肽的含量） 氧化產物抑制比率的較高數值意指對氧化較高的抑制作用和賦形劑對肽（1)的高穩 定作用。
按照表15和表18,可以證實，本發明的賦形劑顯示對氧化的抑制作用，不論水性液體 組合物的肽濃度如何。
[0091] [實驗實施例4]穩定性評價（4) 將制備的水性液體組合物貯存在40°C下的培養箱中4周。然后，按與穩定性評價（1) 中相同的方式測量氧化肽的含量，所述氧化肽是起因于甲硫氨酸殘基氧化的肽。使用C18 反相柱（4. 6 mm X 150 mm，5 μ m)，并使用純水、乙腈和三氟乙酸用于流動相。
[0092] 在比較實施例中得到的水性液體組合物中，將表14中描述的比較實施例20-23在 40°C下貯存4周。在貯存后氧化肽的含量見表19。通過下式計算表中氧化產物的抑制比 率。
[0093] 抑制比率（%) = {(對照樣品（比較實施例20)中氧化肽的含量）-(表19中比較實 施例的氧化肽的含量）} X KKV(對照樣品（比較實施例20)中氧化肽的含量） 氧化產物抑制比率的較高數值意指對氧化較高的抑制作用和賦形劑對肽（1)的高穩 定作用。
[0094] [表 19] CN 105142656 A 說明書 19/24 頁
如表19所示，證實了與對照相比，加入作為常用于液體制劑的抗氧化劑的抗壞血酸、 巰基乙醇酸鈉或焦亞硫酸鈉不能穩定肽（1)，并增加氧化產物。
[0095] [實驗實施例5]特異性CTL誘導活性的證實 將水性液體組合物36、37和38與佐劑混合，得到癌癥疫苗組合物。
[0096] 1)癌癥疫苗組合物al、a2的制備 作為佐劑a，使用不完全弗氏佐劑。將水性液體組合物36用不含肽的10 mM酒石酸+ 50 mM甲硫氨酸溶液稀釋1. 7倍。將450 μ L前述混合物吸入玻璃注射器（Top Corp.)中， 使該注射器在接合處與含有450 μ L佐劑a的另一個玻璃注射器連接。交替壓下兩個玻璃 注射器的內筒30次以上，以使溶液乳化，藉此得到癌癥疫苗組合物al。
[0097] 同樣，將水性液體組合物38用不含肽的10 mM酒石酸+ 200 mM甲硫氨酸溶液稀 釋1. 7倍，在類似情況下使用佐劑a處理，得到癌癥疫苗組合物a2。
[0098] 2)癌癥疫苗組合物bl、b2的制備 將油酸乙酯（96. 5 g)、脫水山梨醇單油酸酯（17. 5 g)、聚氧乙烯氫化蓖麻油10 (4. 5 g)、濃甘油（1.5 g)和25 mM磷酸二氫鈉水溶液（20.0 g)提前吸入300 mL玻璃高量杯中。 然后，使用 CLEAMIX CLM-L 5 (M Technique Co.，Ltd )以 10000 rpm 攪拌混合物 5 分鐘， 得到佐劑b。
[0099] 然后，將400 μ L水性液體組合物37和930 μ L佐劑b用試管混合器（touch mixer MT-51，Yamato Scientific Co.，Ltd.)混合，得到癌癥疫苗組合物 bl。
[0100] 此外，在類似條件下處理水性液體組合物38和佐劑b，得到癌癥疫苗組合物b2。
[0101] 3)癌癥疫苗組合物cl、c2的制備 將油酸乙酯（49.0 g)、肉豆蔻酸辛基十二烷基酯（49.0 g)、脫水山梨醇單油酸酯（7.0 g)、甘油單油酸酯（9. 8 g)、聚氧乙烯氫化蓖麻油20 (I. 4 g)、濃甘油（I. 4 g)和25 mM磷 酸二氫鈉水溶液（22.4 g)提前吸入300 mL玻璃高量杯中。然后，使用CLEAMIX CLM-1. 5 (M Technique Co.，Ltd.)以10000 rpm攪拌混合物5分鐘，得到佐劑c。
[0102] 然后，將400 μ L水性液體組合物36和930 μ L佐劑c用試管混合器（touch mixer MT-51，Yamato Scientific Co.，Ltd.)混合，得到癌癥疫苗組合物 cl。
[0103] 此外，在類似條件下處理水性液體組合物38和佐劑c，得到癌癥疫苗組合物c2。
[0104] 4) CTL誘導活性評價 使用 HLA-A*0201 轉基因小鼠（Eur. J. Immunol·: 34，3060，2004)，評價的上述 1)-3)中制備的6種癌癥疫苗組合物（al-c2)誘導特異性CTL的能力。
[0105] 將100 μ L的各癌癥疫苗組合物（600 μ g，按肽劑量）皮內給予HLA-Ai^Ol轉基 因小鼠尾根部。每組使用3只小鼠。在給藥后7天分離出脾，制備脾細胞。將一部分脾細胞 用100 ymol/L肽⑴脈沖1小時。脈沖意指將肽⑴加入脾細胞中，使得抗原肽與細胞表 面上的HLA結合。將未用肽（1)脈沖的脾細胞和用肽脈沖的上述脾細胞混合，以7. 8X IO6個細胞/孔接種到24孔板中培養。作為培養基，使用補充有10% FCS、10 mM HEPES、20 mM L-谷氨酰胺、I mM丙酮酸鈉 、I mM MEM非必需氨基酸、1% MEM維生素和55 μ M 2-巰基乙 醇的RPMI1640培養基，將細胞培養5天。通過51Cr釋放測定法（J. Immunol. : 159，4753， 1997)，測定給予的肽對培養的脾細胞的特異性CTL活性。對于HLA-A*0201和H-2Db嵌合 MHC I類分子的穩定表達，使用通過基因轉移至小鼠淋巴瘤來源的細胞系在巴斯德研究中 心（Institut Pasteur)制備的細胞系 EL4-HHD 細胞（J. Exp. Med. : 185，2043，1997) 〇 以3. 7 MBq/5 X IO5個細胞對靶細胞進行51Cr標記1小時，加入前述肽至167 μ mol/L，將細 胞進一步脈沖1小時。另外，未用前述肽脈沖（未脈沖）的靶細胞經51Cr標記2小時，得到 對照靶細胞。將標記的靶細胞和較早制備的脾細胞以1:20的比率混合，培養4小時，從受 損靶細胞的比率，確定CTL誘導活性（即細胞毒性）。結果見圖1。以每給藥小組3只小鼠 的平均值表示細胞毒性。
[0106] 如圖1所示，給予使用本發明的水性液體組合物制備的癌癥疫苗組合物的組針對 用前述肽脈沖的靶細胞顯示高細胞毒性，但是顯示針對未用