A)分 子，其導致膀胱細胞中的基因表達調控，提供臨床上有用的調節。這些反義RNA、miRNA或 SiRNA可涉及下調或抑制或降低涉及腫瘤發生或腫瘤生長的基因的表達。
[0072] 例如但不限于，治療性轉基因可編碼CD40L或IL-15蛋白。在一個實施例中，編碼 ⑶40L和IL-15的治療性轉基因可在同一對象中聯合使用以達到治療效果。⑶40L和IL-15 轉基因可同時包括在同一桿狀病毒載體中，或可包括在不同桿狀病毒載體中并隨后遞送至 同一對象。
[0073] 為將核酸分子遞送至膀胱細胞，使膀胱細胞與桿狀病毒載體接觸。接觸可包括例 如將桿狀病毒載體加入含有膀胱細胞的組織培養基中，使得桿狀病毒載體轉導膀胱細胞。 接觸可包括將桿狀病毒載體給予對象。
[0074] 因此，核酸分子將要遞送至的膀胱細胞可以是在需要治療或預防膀胱癌的對象體 內，包括哺乳動物，包括人。
[0075] 因此，該方法可在體內膀胱細胞是癌細胞、是腫瘤的一部分、傾向于成為癌細胞或 待預防使之不會變成癌細胞的情況下進行。
[0076] 因此，使膀胱細胞接觸桿狀病毒載體包括向對象給予有效量的桿狀病毒載體。本 文所用術語"有效量"指有效地實現所需結果必需的劑量和持續的時間的量，例如為治療或 預防膀胱癌，包括預防或降低之前已患有膀胱癌（包括淺表性膀胱癌，包括TCC)的患者中 膀胱癌的復發風險。
[0077] 相對于膀胱癌，本文所用"治療"指用于獲得有益或所需結果（包括臨床結果）的 方法。有益或所需的臨床結果可包括但不限于一種或多種癥狀或病癥的改善或緩和、疾病 程度的減弱、疾病狀態的穩定、疾病發展的預防、疾病擴散的預防、疾病復發的預防、疾病進 展或復發的延遲或延緩、疾病發生的延遲或延緩、疾病狀態的緩和或減輕，以及緩解（部分 或全部）。"治療"還可表示將對象的存活期延長至超過不進行治療的情況下所能預期的存 活期。"治療"還可指抑制疾病的進展或復發、暫時性延緩疾病的進展或復發，但更優選地， 其涉及永久性阻止疾病的進展或復發。
[0078] 已提出將來源于昆蟲桿狀病毒苜蓿銀紋夜蛾多重核型多角體病毒（AcMNPV)的重 組載體作為用于基因治療（包括用于癌癥基因治療）的載體（Hofmann C等，1995 ;Kost TA 等，2005 ;Hu YC，2008,2010 ;Wang S等，2010)。Takaku等通過桿狀病毒激活NK細胞依賴的 抗腫瘤免疫（Kitajima M等，2008a)。桿狀病毒誘導的抗腫瘤作用可涉及通過增強腫瘤特 異性細胞毒性T淋巴細胞（CTL)應答和腫瘤特異性抗體生成實現的獲得性免疫（Kitajima M等，2008b ;SuZuki T等，2010)。因此，桿狀病毒的免疫刺激特性可用于所述方法以進行癌 癥免疫治療。
[0079] 可使用本領域已知的標準技術將桿狀病毒載體給予對象。該桿狀病毒載體可系統 性給予，或可通過膀胱內灌注給予至膀胱。
[0080] 應理解，膀胱是一種空心器官，允許非外科手術的膀胱內給藥通過尿道導管并通 過內窺鏡的方法評估療效。利用經膀胱內遞送的治療劑在局部起作用，系統性暴露有限，且 淺表性膀胱癌易于接近。
[0081] 通過哺乳動物細胞的體內桿狀病毒轉導，系統性遞送的桿狀病毒載體的失活可導 致病毒被血清補體蛋白（先天免疫系統的主要組分）識別的后果（Hofmann C等，1998)。在 免疫活性動物中，系統性遞送的桿狀病毒載體可能無法表達。桿狀病毒的高效價已被用于 克服補體中和病毒的能力；然而，該方法仍無法導致桿狀病毒介導的轉基因表達（Kitajima M等，2008a)。因此，可通過尿道在膀胱內插入導管進行膀胱癌治療以避免系統性病毒給予 的許多缺陷，如血清補體使病毒失活。
[0082] 如本文所述方法所示，經膀胱內給予的桿狀病毒可顯示出強的免疫刺激能力以誘 導炎癥細胞因子的表達或促進其釋放。該發現與先前的研宄一致，先前的研宄發現注射進 動物體后桿狀病毒可引起保護性先天免疫應答。桿狀病毒還可誘導適應性免疫，其特征是 特異性針對病毒基因產物的免疫應答（Pieroni等，2001 ;Abe等，2005)。
[0083] 不受理論的限制，可治療性利用上述免疫刺激作用以抑制腫瘤生長。該假說得到 了以下觀察的支持，即經膀胱內遞送不表達任何轉基因的桿狀病毒能夠延長具有已建立的 原位膀胱癌的免疫活性小鼠的存活。該同源模型系統提供了完整的免疫功能，允許進行針 對膀胱癌的基于治療性桿狀病毒的治療的研宄。
[0084] 為提高桿狀病毒載體經膀胱內灌注后膀胱細胞的攝取效率，所述方法還包括使用 轉染試劑。例如，在使桿狀病毒載體經由膀胱內灌注接觸膀胱細胞前，可首先使用轉染試劑 處理評估一段給定時間。
[0085] 轉染試劑是本領域已知的；例如，所述轉染試劑可以是聚L-賴氨酸、Clorpaction WCS-90、十二烷基-B-dd-麥芽苷（DDM)或十二烷基硫酸鈉（SDS)或其任何組合。
[0086] 然而，我們觀察到，在不使用轉染試劑對膀胱細胞進行任意預處理的情況下使用 所述方法會改變健康（非癌）膀胱細胞相比膀胱癌細胞對桿狀病毒載體的攝取。因此，在 一些實施方式中，所述方法省去了轉染試劑的任意使用，從而與健康膀胱細胞相比優先靶 向膀胱癌細胞。
[0087] 待給予桿狀病毒載體的濃度和量可以變化，取決于待治療的膀胱癌、桿狀病毒載 體中所包括轉基因的類型、給藥模式、其他同時進行的治療以及對象的年齡和健康程度。通 過改變膀胱內灌注的頻率，可以提高存活和癌癥預防或治療。
[0088] 如上文所述，可通過在桿狀病毒載體中包括治療性轉基因以提高桿狀病毒載體的 效率。
[0089] 為幫助給藥，桿狀病毒載體可配制為藥物組合物的成分。
[0090] 因此，還提供了包含上述桿狀病毒載體和可選的藥學上可接受的稀釋劑的藥物組 合物。這類藥物組合物可用于治療膀胱癌，如上文所述。
[0091] 組合物可以常規地包含藥學上可接受濃度的鹽、緩沖試劑、防腐劑和各種相容性 載體。對于所有遞送形式，桿狀病毒載體都在生理鹽水溶液中配制。
[0092] 藥學上可接受稀釋劑的比例和特性可由選定的給藥途徑、與肝細胞和肝病毒顆粒 的相容性和標準藥學實踐所決定。通常，藥物組合物可使用不會殺傷或顯著損傷桿狀病毒 載體的生物學特性的組分配制。
[0093] 可通過適于向對象給藥的藥學上可接受的組合物制備的已知方法制備該藥物組 合物，使得有效量的桿狀病毒載體和任何其他活性物質混合于具有藥學上可接受的載劑的 混合物中。例如，在Remington's Pharmaceutical Sciences (《雷明頓藥物科學》，麥克出 版公司，美國賓夕法尼亞州伊斯頓，1985)中描述了合適的載劑。基于此，藥物組合物可包括 但不限于桿狀病毒載體溶液，連同一種或多種藥學上可接受的載劑或稀釋劑，并包含于具 有合適pH和使用生理流體等滲的緩沖溶液中。
[0094] 藥物組合物需使用的劑量取決于待治療的具體病癥、病癥的嚴重程度、對象個體 參數（包括年齡、身體狀況、尺寸和重量）、治療的持續時間，（若有的話）同時治療的特性、 具體的給藥途徑和衛生專業人員知識和技能范圍內的其它類似因素。這些因素是本領域技 術人員已知的，并可用最少的常規實驗解決。
[0095] 還涉及了所述桿狀病毒載體的多種用法。因此，提供了用于在需要膀胱癌治療的 對象中進行膀胱內灌注的桿狀病毒載體，桿狀病毒載體在通過膀胱內灌注桿狀病毒載體治 療需要這類治療的對象中的膀胱癌中的用途，桿狀病毒載體在制造用于通過膀胱內灌注桿 狀病毒載體治療需要這類治療的對象中的膀胱癌的藥物中的用途，桿狀病毒載體在需要膀 胱癌治療的對象中進行膀胱內灌注中的用途，以及桿狀病毒載體在制造用于在需要膀胱癌 治療的對象中進行膀胱內灌注的藥物中的用途。
[0096] 本發明的方法和用途用以下非限制性實施例進一步舉例說明。 實施例
[0097] 實施例1
[0098] 研宄了用于膀胱癌治療的基于昆蟲桿狀病毒的載體的用途。首先顯示了經膀胱內 遞送的桿狀病毒載體可有效地轉導正常小鼠膀胱。在測試的3種不同桿狀病毒載體中，通 過在病毒基因組中整合有哺乳動物表達盒（包含人巨細胞病毒即時早期基因啟動子、土撥 鼠肝炎病毒轉錄后調控元件以及來自1型人T細胞白血病病毒的長末端重復的R片段和一 部分U5序列構建）的新的重組桿狀病毒載體提供了最高的體內轉導效率。隨后研宄了單獨 的病毒轉導是否能夠刺激抗腫瘤免疫。通過使用鼠細胞因子/趨化因子抗體陣列以分析收 集自接受膀胱內給予不含任何轉基因的桿狀病毒的小鼠的膀胱組織提取物，陣列中59%的 蛋白（32個中的19個）顯示超過2倍的表達增加，其中粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子、 粒細胞集落刺激因子和皮膚T細胞虜獲趨化因子是上調最大的三個蛋白。更重要地，治療 顯著延長了具有原位膀胱癌小鼠的存活，50%的動物存活了超過6個月。使用桿狀病毒載 體以將CD40配體基因經膀胱內遞送至具有侵略性原位膀胱癌發展的小鼠的膀胱中時，檢 測到腫瘤的優先轉導以及隨后腫瘤生長和平均膀胱重量的降低。
[0099] 材料與方法
[0100] 桿狀病毒制備：根據生產商的說明手冊，使用BAC-to-BAC?桿狀病毒表達 系統（英杰公司（Invitrogen))構建重組桿狀病毒載體CMV-Luc、CMV-Luc-WPRE和 CMV-RU5-Luc-WPRE。CMV-Luc包含在人巨細胞病毒（CMV)早期啟動子控制下的熒光素酶基 因。CMV-Luc-WPRE在3'非翻譯區（UTR)處具有額外的土撥鼠肝炎病毒轉錄后調控元件 (WPRE)。CMV-RU5-Luc-WPRE在5' UTR處具有另一個調控元件RU5,來自1型人T細胞白血 病病毒的長末端重復的R片段和部分U5序列。使用相應的桿狀病毒質粒（bacmid)通過 Sf9昆蟲細胞的轉染生產這些表達熒光素酶的病毒。在用包含表達盒和線性化AcMNPV病毒 DNA(克隆泰克公司（Clonetech))的pBacPAK9轉移載體共轉染Sf9昆蟲細胞后，通過同源 重組生產BV-⑶40L(⑶40配體）病毒，該病毒含有CMV啟動子（在5' UTR處具有RU5且在 3' UTR處具有WPRE)控制下的小鼠⑶40L基因（英杰公司）。BV-IL-15(白介素15)病毒 的構建方法與BV-CD40L類似，但使用小鼠 IL15基因。具有受病毒多角體蛋白啟動子驅動 的IacZ基因的親本病毒BacPAK6獲自克隆泰克公司。以0. 1的MOI在Sf9細胞中擴增重 組桿狀病毒并在病毒感染后3天收集含病毒的上清液。病毒以28, OOOg沉淀1小時并重懸 于PBS中。
[0101] 細胞系和體外桿狀病毒轉導：Sf9昆蟲細胞（英杰公司）維持在sf-900111無血 清培養基（英杰公司）中。鼠膀胱癌細胞系MB49來自Esuvaranathan博士（國立大學醫 院，新加坡）的饋贈，并且人膀胱癌細胞系T24購自ATCC。細胞系在37°C和5% CO2下維持 在補充有10%胎牛血清（猶他州洛根的海克隆公司（Hyclone))、2mM L-谷胺酰胺、1%青霉 素和鏈霉素（西格瑪公司（Sigma))的RPMI 1640中。為獲得具有變化的生長行為的克隆 MB49變體以促進我們對于膀胱癌生長的分子機制的理解，使用pRC2/CMV-Luc(-種質粒， 具有CMV啟動子驅動的熒光素酶基因和SV40啟動子控制下的新霉素抗性基因）轉染野生 型MB49細胞。轉染的細胞使用G418在700 μ g/ml的濃度下選擇，持續2周。在當前的研 宄中還使用了在小鼠膀胱中具有高腫瘤建立率和較低生長速率的亞克隆MB49S1。對于體外 桿狀病毒轉導實驗，將腫瘤細胞與桿狀病毒載體以100的MOI在37°C下孵育過夜。轉基因 表達水平在轉導后24小時測量。
[0102] 動物、動物模型和體內桿狀病毒轉導：使用了成年雌性C57BL/6小鼠和成年雌性 balb/c裸小鼠（重20g，5-6周齡）。通過在C57BL/6小鼠中經膀胱內灌注同源MB49細 胞，在膀胱的內腔表面上產生原位膀胱腫瘤。腫瘤接種前，使用親脂性、近紅外熒光染料 DiR(20ng/ml過夜，卡鉗生命科學公司（Caliper Life Sciences))對MB49細胞進行預標 記以促進成瘤率的體內監控。將24號導管（BD醫療（BDMedical))通過用于膀胱內灌注的 尿道導入麻醉的雌性小鼠膀胱內。擠出殘留的尿液后，將100 μ 1的10 μ g/ml聚L-賴氨酸 (PLL，分子量70, 000-150, 000,西格瑪公司）注入膀胱。在擠出前使PLL溶液在膀胱內停留 30分鐘。隨后使用100 μ 1的PBS清洗膀胱。預處理后，灌注含100 μ I MB49S1或MB49膀 胱癌細胞的PBS并在膀胱中停留1小時。在大多數實驗中使用每只動物lx IO5個癌細胞 的劑量，CD40L和/或IL-15治療研宄除外，其中使用了每只動物2x IO4個細胞的低劑量。 此后，移開導管并通過自發排泄使膀胱排空。在膀胱內灌注后24小時使用與CCD相機和 ICG濾光器偶聯的IVIS 100體內成像系統（卡鉗生命科學公司（Caliper Life Sciences)) 測量成瘤率。使用Xenogen活體成像軟件v2. 5獲取并分析圖像和熒光信號。選擇成功植 入MB49細胞和具有類似腫瘤負擔的動物并在后續實驗中使用。對于膀胱內的體內桿狀病 毒轉導，對小鼠進行麻醉和插管。在30分鐘的聚L-賴氨酸處理后灌注含桿狀病毒載體的 PBS(K)O μ 1中lx IO8Pfu病毒顆粒）并停留1小時。
[0103] 為評估膀胱中的體內轉導效率，使用具有熒光素酶報告基因的桿狀病毒載體轉 導具有或沒有原位腫瘤植入的小鼠并在腹膜內注射150mg/kg熒光素（普洛麥