轉導對 照。在桿狀病毒轉導后1周收集膀胱用于分析。（A)⑶40L表達延緩腫瘤生長。DiR熒光圖 像顯示各動物中最初的腫瘤負擔，H&E染色顯示腫瘤發展。（B)膀胱重量差異。數據以平均 值+偏差的形式顯示，每組η = 5。*通過斯氏t檢驗相對BacPAK6組p〈0. 05。
[0041] 圖7.共同遞送⑶40L和IL-15對于具有膀胱癌小鼠存活的影響。（A)通過桿狀病 毒載體共同遞送CD40L和IL-15延長了具有膀胱癌小鼠的存活。在接種IO 5個MB49細胞后 2天進行桿狀病毒載體的膀胱內灌注。顯示了直至第100天的存活曲線。（B)H&E染色顯示 使用表達⑶40L和IL-15的桿狀病毒載體治療的一只小鼠中MB49腫瘤完全停止了。
[0042] 發明詳述
[0043] 本文所述方法和用法涉及桿狀病毒載體可用于膀胱癌治療的發現，包括在已患有 膀胱癌的對象中降低或防止癌癥復發。桿狀病毒載體可不含任何轉基因插入，用于刺激抗 腫瘤免疫應答。可在桿狀病毒載體中包括治療性核酸以加強或補充抗腫瘤應答。在某些條 件下，包括在膀胱內遞送的情況下，桿狀病毒載體可優先轉導膀胱腫瘤細胞而不轉導健康 的非癌膀胱細胞。
[0044] 因此，提供了一種使用桿狀病毒載體將核酸分子遞送至膀胱細胞的方法。所述方 法包括使膀胱細胞接觸桿狀病毒載體，導致膀胱細胞被桿狀病毒載體轉導。
[0045] 應理解，通過病毒或病毒載體進行細胞轉導指將病毒載體或病毒基因組遞送至細 胞內，即由病毒核酸材料感染細胞。在由桿狀病毒載體進行哺乳動物細胞轉導的情況下，轉 導并不指產物感染或病毒基因組在細胞內復制的能力。
[0046] 進行接觸的膀胱細胞可以是任何膀胱細胞。所述膀胱細胞可以是體外膀胱細胞， 包括組織培養物中的細胞，如來自已建立的膀胱細胞系的細胞、組織培養物中的原代膀胱 細胞、來自對象的外植的膀胱細胞、轉化或永生化的膀胱細胞。所述膀胱細胞可以是對象中 的體內膀胱細胞，包括哺乳動物對象中，包括人對象。例如，所述膀胱細胞可以是在需要膀 胱癌治療的對象中。所述膀胱細胞可以是轉基因膀胱細胞，包括體外或體內環境中，包括例 如包含轉基因膀胱細胞的動物模型。
[0047] 所述膀胱細胞可以是健康的，即非癌膀胱細胞，或者其可以是膀胱癌細胞，包括腫 瘤中或從腫瘤上切下的膀胱癌細胞，或者其可以是傾向于成為癌細胞的膀胱細胞，包括例 如攜帶傾向于使膀胱細胞成為癌細胞的突變的膀胱細胞。
[0048] 與膀胱細胞接觸的桿狀病毒載體可以是任何桿狀病毒載體。桿狀病毒載體是 本領域已知的，且最常使用的桿狀病毒載體來源于苜蓿銀紋夜蛾多重核型多角體病毒 (Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus) (AcMNPV)。桿狀病毒是一種 昆蟲DNA病毒，其具有進入哺乳動物細胞的能力但不復制或對所轉導細胞產生毒性。桿狀 病毒在增殖的和非增殖的、靜息的細胞中都具有廣泛的趨向性，在哺乳動物活性啟動子的 支持下能夠在體外和體內有效地將感興趣的基因轉移至多種哺乳動物細胞類型中。該病毒 可進入哺乳動物細胞但不能通過昆蟲特異性啟動子表達其自身基因；因此，桿狀病毒無法 復制并在脊椎動物細胞中表達病毒蛋白，因此不會引起作為病毒編碼基因體內表達結果的 免疫應答、不會與預存的病毒材料重新結合，也不會協助人體中其他病毒的復制。哺乳動物 細胞中桿狀病毒的感染引起不可見的細胞病變效應，甚至在高MOI時也是如此（Shoji等， 1997)〇
[0049] 使用桿狀病毒AcMNPV例如作為基因遞送載體的另一個吸引人的優勢是其130kb 病毒基因組賦予的大克隆容量，優選用于從單個載體遞送大的功能基因或多個基因。在人 細胞中，攜帶哺乳動物表達盒的桿狀病毒載體能夠有效地調節瞬時表達，因為轉基因載體 通常不會整合至所轉導細胞的基因組中。因此，理想情況下，桿狀病毒載體適用于需要短 期、高水平轉基因表達的應用并具有低的插入突變風險。
[0050] 桿狀病毒轉導的另一個重要優勢是人體中不存在針對昆蟲表達的預存免疫（Wang S等，2010)，因為該表達并不對人傳染。Strauss等報道了人血清樣品中針對5型腺病毒的 中和抗體的普遍程度為65%，而無一血清樣品對桿狀病毒中和抗體呈陽性（Strauss R等， 2007)。在同一研宄中，在人體中可檢測到預存的腺病毒特異性T細胞，但沒有預存的桿狀 病毒特異性T細胞。與腺病毒相比，桿狀病毒具有較低的免疫原性，這可以由較少數目的病 毒特異性T細胞得到誘導證明（Strauss R等，2007)。
[0051] 而且，與許多其他基因治療病毒載體不同，桿狀病毒載體可在無血清細胞培養基 中產生，這就消除了來自貢獻血清的動物的病毒和朊病毒物質所造成的潛在血清污染危 險。
[0052] 不含任何轉基因，桿狀病毒自身可以是待遞送至膀胱細胞的核酸。即，遞送可導致 細胞被桿狀病毒載體核酸物質轉導或將其吸收。
[0053] 在其他實施方式中，桿狀病毒載體可包括編碼將在膀胱細胞中表達的表達產物的 轉基因編碼序列。應理解，編碼表達產物的轉基因編碼序列將可操作地連接至所有必需的 調控序列，包括啟動子區域，以在膀胱細胞中產生所需的表達產物的表達概況。當序列以功 能關系設置時，第一核酸序列可操作地連接至第二核酸序列。例如，編碼序列可操作地連接 至啟動子，前提是所述啟動子激活并驅動該編碼序列的轉錄。因此，與膀胱細胞接觸的桿狀 病毒載體還可包括用于在膀胱細胞中表達的轉基因，其可操作地連接至驅動該轉基因在膀 胱細胞中表達的啟動子。
[0054] 在一些實施方式中，可操作地連接至轉基因編碼序列的啟動子包括人巨細胞病毒 立即早期啟動子。在一些實施方式中，該啟動子包括具有SEQ ID NO: 1所列序列的人巨細 胞病毒立即早期啟動子。
[0055] TTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTAC GGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAA CGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTG TATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGAC CTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGT ACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTG TTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCG TGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATC[SEQ ID NO:1]
[0056] 在一些實施方式中，桿狀病毒載體包括基本由具有SEQ ID NO: 1所列序列的人巨 細胞病毒立即早期啟動子組成的啟動子。在一些實施方式中，所述啟動子由具有SEQ ID NO: 1所列序列的人巨細胞病毒立即早期啟動子組成。
[0057] 本文中使用的"基本由……組成"指該核酸序列包括一個或多個核苷酸堿基，包括 在序列內或序列的一個或兩個末端處，但額外的核苷酸堿基不會實質影響核苷酸序列的功 能，例如在膀胱細胞中作為啟動子以驅動可操作連接的編碼序列表達。
[0058] 在其他實施方式中，所述啟動子是與SEQ ID NO: 1具有至少80%、至少85%、至少 90%、至少95%或至少99%序列相同性，同時仍保留驅動膀胱細胞中基因表達能力的人巨 細胞病毒立即早期啟動子。
[0059] 所述桿狀病毒載體還可包括轉錄后調節元件，包括例如來自土撥鼠肝炎病毒的轉 錄后調控元件，位于轉基因的3'非翻譯區。在一些實施方式中，所述桿狀病毒載體包括包 含SEQ ID N0:2所列序列的來自土撥鼠肝炎病毒的轉錄后調控元件。
[0060] CGATAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTT TACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCT TGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTG TTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCT CCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACA ATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAGCTGACGTCCTTTCCATGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGG ACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCC TCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTG[SEQ ID NO :2]
[0061] 在一些實施方式中，桿狀病毒載體包括基本由SEQ ID NO:2所列序列組成的來自 土撥鼠肝炎病毒的轉錄后調控兀件。在一些實施方式中，桿狀病毒載體包括由SEQ ID NO: 2 所列序列組成的來自土撥鼠肝炎病毒的轉錄后調控元件。
[0062] 在其他實施方式中，在一些實施方式中，桿狀病毒載體包括與SEQ ID NO: 2具有至 少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%序列相同性，同時仍保留指導膀胱細胞 中基因表達能力的來自土撥鼠肝炎病毒的轉錄后調控元件。
[0063] 桿狀病毒載體還可在轉基因的5'非翻譯區包括來自1型人T細胞白血病病毒的 長末端重復的R片段和至少一部分U5序列，包括例如其中來自包含SEQ ID N0:3所列序列 的1型人T細胞白血病病毒的長末端重復的R片段和至少一部分U5序列。
[0064] GGCTCGCATCTCTCCTTCACGCGCCCGCCGCCCTACCTGAGGCCGCCATCCACGCCGGTTGAGTCGC GTTCTGCCGCCTCCCGCCTGTGGTGCCTCCTGAACTGCGTCCGCCGTCTAGGTAAGTTTAAAGCTCAGGTCGAGA CCGGGCCTTTGTCCGGCGCTCCCTTGGAGCCTACCTAGACTCAGCCGGCTCTCCACGCTTTGCCTGACCCTGCTTGC TCAACTCTACGTCTTTGTTTCGTTTTCTGTTCTGCGCCGTTACAGATCCAAGCTGTGACCGGCGCCTAC[SEQ ID NO: 3]
[0065] 在一些實施方式中，桿狀病毒載體包含基本由SEQ ID N0:3所列序列組成的來自1 型人T細胞白血病病毒的長末端重復的R片段和至少一部分U5序列的上游5'調控區。在 一些實施方式中，所述桿狀病毒載體包含由SEQ ID N0:3所列序列組成的來自1型人T細 胞白血病病毒的長末端重復的R片段和至少一部分U5序列的上游5'調控區。
[0066] 在其他實施方式中，在一些實施方式中，桿狀病毒載體包括與SEQ ID NO: 3具有至 少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%序列相同性，同時仍保留指導膀胱細胞 中基因表達能力的來自土撥鼠肝炎病毒的轉錄后調控元件。
[0067] 可使用本領域技術人員已知的標準技術（如PCR和分子克隆技術）對桿狀病毒載 體進行修飾。例如可使用市售可得的克隆和表達系統，如BAC-T0-BAC?桿狀病毒表達系統 (吉布可BRL公司（Gibco BRL)，生命技術公司（Life Technologies)，美國），容易地對桿 狀病毒進行修飾。
[0068] 除調控區外，所述桿狀病毒還可包括轉基因編碼序列。術語轉基因指對桿狀病毒 而言是外源的基因，滿足例如，由桿狀病毒載體表達轉基因指表達對桿狀病毒基因組而言 是外源的基因。轉基因編碼序列可編碼需要在膀胱細胞中表達的任何表達產物。例如，轉 基因可編碼治療性蛋白或RNA、選擇性蛋白或RNA標記物、可檢測的報告蛋白或RNA或者為 膀胱細胞對選擇性環境調節提供抗性的RNA或蛋白。轉基因還可編碼調控RNA，例如調控膀 胱細胞中基因表達的miRNA。
[0069] 例如，轉基因可編碼用于治療膀胱癌的治療性表達產物。因此轉基因可以是治療 性轉基因，包括具有臨床用途的任何基因，如編碼涉及癌癥預防或治療的基因產物（如RNA 或蛋白）的基因，或者涉及癌癥預防或治療的具有細胞調節作用的基因。該基因產物可取 代對象中缺陷或缺失的基因產物、蛋白或細胞調節作用，從而實現膀胱癌的預防或治療。
[0070] 因此，治療性表達產物包括在膀胱細胞中表達時對細胞具有治療作用或在膀胱細 胞中產生所需結果的蛋白或肽。
[0071] 治療性表達產物可以是RNA分子，例如反義RNA、miRNA或小干擾RNA(siRN