使用桿狀病毒載體的膀胱癌治療方法
【專利說明】
[0001] 相關申請的交叉引用
[0002] 本申請要求2012年4月10日提交的美國臨時申請第61/622, 376號的優先權和 權益，其內容通過引用納入本文。
技術領域
[0003] 本發明涉及使用桿狀病毒載體治療或預防膀胱癌的方法。
[0004] 發明背景
[0005] 膀胱癌是尿道中最常見的惡性腫瘤形式。在美國，2011年預計有69, 000例新增病 例和近15, 000人死亡（Siegel R等，2011)。在新加坡，膀胱癌是男性中第9大常見癌癥。
[0006] 幾乎所有膀胱癌都是從變移上皮產生的且因此稱為變移細胞癌（TCC)。大部分的 膀胱TCC在初始診斷中是淺表性的、非肌肉浸潤性的。然而，尿道切除后表面TCC的復發率 可以高達70 %，必需進行輔助治療以控制復發和進展。
[0007] 輔助治療通常使用卡介苗（BCG)以膀胱內免疫治療的形式給予具有中度或高度 癌癥復發風險的患者。BCG由減毒的活牛結核菌生成并可激活CD4+Thl細胞因子（如白介 素2(幾-2)、幾-12、幾-18和干擾素丫（1即-丫））介導的先天免疫應答。然而，由于此6難治 性、耐藥性、復發或不耐受，多達40%的患者會在第一年中發生BCG免疫治療失敗（Zlotta AR等，2009 ;Chiong和Esuvaranathan，2010)。因此，存在開發新的輔助療法以提高淺表性 膀胱癌患者治療結果的需要。
[0008] 已被開發作為可能的膀胱癌輔助治療的基于病毒載體的基因治療包括疫苗病 毒（Lee SS 等，1994;Gomella LG 等，2001;Siemens DR 等，2003;Fodor I 等，2005)、腺病 毒（Morris BD 等，1994;Sutton MA 等，2007;Kuball J 等，2002;Siemens DR 等，2003; Pagliaro LC 等，ZOOSiMalmstrdmFlU等，2010)、金絲雀痘病毒（Siemens DR 等，2003)、呼 腸孤病毒（Hanel EG等，2004)、逆轉錄病毒（Shiau AL等，2001 ;Kimura T 等，2003 ;Dumey N 等，2005 ;Kikuchi E等，2007)、慢病毒（Kikuchi E等，2004)和水泡性口炎病毒（Hadaschik BA等，2008)。已報道了至少5個臨床實驗，其涉及使用復制型疫苗病毒和腺病毒載體治療 膀胱癌（Gomella LG 等，2001 ;Kuball J 等，2002 ;Pagliaro LC 等，2003 ;Burke J，2010; Malmstrdm PU 等，2010)。
[0009] 經測試用于癌癥基因治療的多種類型病毒載體中有反轉錄病毒。反轉錄病毒的生 命周期包括宿主基因組中的整合狀態，從而允許治療基因的長期、穩定表達。關于反轉錄 病毒使用的一個主要問題是這些載體優先整合至基因組的轉錄活躍區域，這會導致插入突 變、癌基因激活和細胞轉化。進行SCID-Xl的基因治療后法國和英國數名兒童發生白血病 (Hacein-Bey-Abina等，2003)使得病毒載體相關的潛在風險受到嚴格審查。
[0010] 腺病毒和腺相關病毒（AAV)來源的病毒載體具有低得多的插入突變風險且已經 過癌癥基因治療的測試（Cross和Burmester，2006 ;Palmer等，2006)。還在動物模型和至少 4個早期臨床試驗中對腺病毒載體進行了膀胱癌基因治療的廣泛測試（Kuball J等，2002; Pagliaro LC 等，2003 ;Burke J，2010 ;Malmstr0m I3U 等，2010)。然而，作為感染性人病毒， 腺病毒和 AAV 激活人免疫系統（CalcedoR 等，2009 ;Huang 和 Yang，2009 ;Nayak 和 Herzog， 2010)。AAV載體有效地激活B細胞（Huang和Yang，2009)且根據年齡組和地理位置，在35 至80%的個體中檢測到了針對AAV2的特異性抗體（Calcedo R等，2009)。雖然處于非常低 的頻率，AAV衣殼特異性⑶8+記憶T細胞存在于人中并可在AAV轉導后被重新激活（Nayak 和Herzog，2010)。針對腺病毒的預存免疫甚至是更普遍的（Bessis N等，2004 ;Nayak和 Herzog，2010)。在超過97 %的人中檢測到了針對C群腺病毒的預存抗體，并在約50 %的人 中檢測到了通常用于產生腺病毒載體的針對血清型2腺病毒的預存抗體（Nayak和Herzog， 2010)。對于T細胞介導的免疫，在人外周血中檢測到了針對不同腺病毒血清型的CD4+和 CD8+交叉反應性T細胞（Nayak和Herzog，2010)。
[0011] 鑒于可能的不希望發生的排斥反應，對于在基因治療中使用人感染性病毒來源的 載體，預存免疫是一個問題。在預存抗病毒免疫不會引起嚴重病理變化的情況下，仍能夠使 病毒載體失活，從而影響轉導效率。在沒有預存免疫的患者中，由于腺病毒是高度免疫原性 的，腺病毒載體會在第一次給藥后迅速發揮強的抗病毒免疫性。該反應會阻止載體的進一 步使用或使得后續使用的有效性較低。
【發明內容】
[0012] 已在腫瘤模型中對病毒（復制型病毒或復制缺陷型重組病毒載體）進行了膀胱癌 治療的測試。然而，作為膀胱療法的人感染性病毒具有顯著的缺點，包括預存免疫和強免疫 原性相關的問題。相反地，發明人發現基于昆蟲桿狀病毒的載體可為膀胱癌治療提供合適 的載體。
[0013] 因此，本文所述復發涉及使用桿狀病毒治療膀胱癌，包括作為輔助治療以在淺表 性腫瘤切除后防止或降低膀胱癌的復發風險。由于目前病毒載體系統的有效性和安全性方 面的限制，桿狀病毒載體提供了一種可行的替代方案，用于作為輔助治療以誘導免疫或作 為載體以遞送治療性核酸。
[0014] 發明人證明，經膀胱內遞送的桿狀病毒載體能夠有效地轉導正常的（非癌癥攜帶 的）小鼠膀胱。在病毒基因組中整合有哺乳動物表達盒（包含人巨細胞病毒即時早期基因 啟動子）、土撥鼠肝炎病毒轉錄后調控元件以及來自1型人T細胞白血病病毒的長末端重復 的R片段和一部分U5序列的桿狀病毒載體可提供高水平的體內轉導效率。
[0015] 而且，發明人發現單獨的桿狀病毒轉導（桿狀病毒載體中不包括任何治療性轉基 因）可刺激抗腫瘤免疫。通過使用鼠細胞因子/趨化因子抗體陣列以分析收集自接受膀胱 內給予不含任何轉基因的桿狀病毒的小鼠的膀胱組織提取物，陣列中59 %的蛋白顯示超過 2倍的表達增加，包括粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子、粒細胞集落刺激因子和皮膚T細胞 虜獲趨化因子的上調。發現使用桿狀病毒治療能夠延長具有原位膀胱癌小鼠的存活，50% 的動物存活了超過6個月。
[0016] 通過使用桿狀病毒載體以將CD40配體基因遞送至具有侵略性原位膀胱癌發展的 小鼠的膀胱中，觀察到腫瘤的優先轉導以及隨后腫瘤生長和平均膀胱重量的降低。
[0017] 因此，直接經膀胱內灌注桿狀病毒和桿狀病毒基因轉移載體能為膀胱癌提供全新 的治療方案。
[0018] 在一個方面，本發明提供了一種向膀胱細胞遞送核酸分子的方法，包括使膀胱細 胞接觸桿狀病毒載體。
[0019] 該細胞可以是膀胱癌細胞或健康的非癌膀胱細胞，并且可以是體外或體內細胞， 包括在需要膀胱癌治療的對象中。當該細胞是對象中的細胞時，接觸可包括通過膀胱內灌 注向該對象給予桿狀病毒載體。
[0020] 該桿狀病毒載體還包括用于在膀胱癌細胞中表達的轉基因，其可操作地連接至驅 動該轉基因在膀胱細胞中表達的啟動子。例如，該轉基因可以是用于治療膀胱癌的治療性 轉基因，包括例如編碼⑶40L或IL-15的治療性轉基因。
[0021] 在該桿狀病毒載體中，啟動子可包括人巨細胞病毒立即早期啟動子，包括SEQ ID NO: 1所列序列。
[0022] 桿狀病毒載體還可包括來自土撥鼠肝炎病毒的轉錄后調控元件，位于轉基因的3' 非翻譯區，包括例如SEQ ID N0:2所列序列。
[0023] 桿狀病毒載體還可包括來自1型人T細胞白血病病毒的長末端重復的R片段和至 少一部分U5序列，位于轉基因的5'非翻譯區，包括例如SEQ ID N0:3所列序列。
[0024] 該方法還可包括在使膀胱細胞接觸桿狀病毒載體之前或同時加入轉染試劑。所述 轉染試劑可以是例如聚L-賴氨酸、Clorpaction WCS-90、十二烷基-B-dd-麥芽苷（DDM)或 十二烷基硫酸鈉（SDS)或其任何組合。
[0025] 為與本文所述方法保持一致，本發明提供了桿狀病毒載體的多種用法。
[0026] 因此，在另一個方面，本發明提供了用于治療需要這類治療的對象中膀胱癌的桿 狀病毒載體，其中用法包括在對象內經膀胱內灌注桿狀病毒載體。
[0027] 在另一個方面，本發明提供了一種用于在對象的膀胱中經膀胱內灌注的桿狀病毒 載體。
[0028] 在另一個方面，本發明提供了用于通過經膀胱內灌注桿狀病毒載體來治療需要這 類治療的對象中膀胱癌的桿狀病毒載體的用途。
[0029] 在另一個方面，本發明提供了桿狀病毒載體的用途，該桿狀病毒載體用于制造通 過經膀胱內灌注該桿狀病毒載體來治療需要這類治療的對象中膀胱癌的藥物。
[0030] 在另一個方面，本發明提供了用于在對象的膀胱中經膀胱內灌注的桿狀病毒載體 的用途。
[0031] 在另一個方面，本發明提供了桿狀病毒載體的用法，該桿狀病毒載體用于制造用 于在對象的膀胱中經膀胱內灌注的藥物。
[0032] 本領域技術人員根據本發明下面的【具體實施方式】的描述以及附圖和表將會明白 本發明的其它方面和特征。
[0033] 附圖簡要說明
[0034] 下列顯示的附圖和表僅僅是以舉例方式說明了本發明的實施方式。
[0035] 圖1.在balb/c裸小鼠中經膀胱內灌注后小鼠膀胱的桿狀病毒轉導。（A).使用 3種不同桿狀病毒載體轉導的代表性動物中熒光素酶報告基因表達的生物發光圖像。熱圖 代表轉基因表達區域且顏色代表強度。左側顯示了桿狀病毒載體表達盒的示意性結構。縮 寫：CMV :人巨細胞病毒立即早期基因啟動子和增強子；WPRE :土撥鼠肝炎病毒轉錄后調控 元件；RU5:來自1型人T細胞白血病病毒的長末端重復的R片段和部分U5序列。（B).熒 光素酶報告基因表達的時程分析。通過測量生物發光信號對體內基因表達進行定量。數據 以平均值+偏差的形式顯示，每組η = 3。
[0036] 圖2.在C57L/B6小鼠中經膀胱內灌注后小鼠膀胱的桿狀病毒轉導。㈧代表性動 物中熒光素酶報告基因表達的生物發光圖像。使用桿狀病毒載體BV-RU5-LUC-WPRE以每只 小鼠 IO8或10 7個病毒顆粒的劑量轉導小鼠。（B)熒光素酶報告基因表達的時程分析。通 過測量生物發光信號對體內基因表達水平進行定量。數據以平均值+偏差的形式顯示，每 組η = 3。（C)使用針對熒光素酶蛋白的抗體進行免疫染色以顯示膀胱內的桿狀病毒轉導。 在桿狀病毒轉導后24小時收集組織切片。顯示了低放大倍數圖像和高放大倍數圖像。包 括蘇木精和伊紅的染色以顯示桿狀病毒轉導后正常膀胱的結構。
[0037] 圖3.桿狀病毒轉導使膀胱內細胞因子/趨化因子表達上調。（A)收集自C57L/B6 小鼠的樣品的代表性印跡圖像，所述小鼠不接受膀胱內灌注（正常）、分別接受膀胱內PBS 和BacPAK6灌注。在灌注后48小時收獲膀胱并進行勻漿。上清液用于探測細胞因子/趨 化因子抗體陣列。（B)桿狀病毒轉導后小鼠膀胱內細胞因子和趨化因子的相對上調。使用 RiiyBioX分析工具分析密度計量數據。顯示了倍數變化（平均信號強度差異）。數據以 平均值+偏差的形式顯示，每組η = 3。
[0038] 圖4.桿狀病毒轉導的抗腫瘤效果。（A)膀胱內接種小鼠膀胱癌細胞后膀胱中的腫 瘤發展。以每只動物IO 5個癌細胞測試了兩種類型的小鼠膀胱癌細胞ΜΒ49和MB49S1(MB49 細胞的亞克隆）。在接種后14天收獲膀胱。Η&Ε染色顯示與親本ΜΒ49細胞接種所形成的 腫瘤相比，MB49S1腫瘤具有緩慢的生長速率。（B) BacPAK6轉導延長了具有膀胱癌的小鼠的 存活。在接種IO5個MB49S1細胞后7天進行了 BacPAK6( -種不具有哺乳動物基因表達盒 的桿狀病毒載體）的膀胱內灌注。顯示了直至第95天的存活曲線。每組η = 10。使用對 數秩檢驗進行統計學分析。
[0039] 圖5.桿狀病毒載體調節膀胱癌細胞中的⑶40L表達。膀胱癌模型中桿狀病毒 載體的轉導效率。（A)桿狀病毒能夠在體外和體內轉導膀胱癌細胞。使用桿狀病毒載體 BV-RU5-Luc-WPRE以轉導小鼠 ΜΒ49膀胱癌細胞、人Τ24膀胱癌細胞和通過接種ΜΒ49細胞形 成的小鼠原位膀胱腫瘤。通過使用針對熒光素酶蛋白的抗體進行的免疫染色顯示桿狀病毒 轉導后24小時收集的細胞和組織切片中熒光素酶報告基因表達。Η&Ε染色顯示了膀胱腫瘤 生長。（B)⑶40L的桿狀病毒載體表達盒的示意性結構。（C) RT-PCR顯示體外BV-⑶40L轉導 后24小時ΜΒ49細胞中的CD40L表達。⑶通過Western印跡顯示的小鼠 ΜΒ49膀胱腫瘤中 的⑶40L表達。在接種IO5個MB49細胞后3天進行BV-⑶40L的膀胱內灌注。在BV-⑶40L 轉導后24小時收集膀胱。
[0040] 圖6.桿狀病毒介導的⑶40L表達的抗腫瘤效果。在接種2x IO4個DiR標記的 MB49細胞后3天進行BV-⑶40L的膀胱內灌注。包括膀胱內灌注BackPAK6以作為