紅細胞、B型磁化紅細胞、0型磁化紅細胞50ul;
[0215] (4)混勻，室溫反應lmin;
[0216] (5)磁鐵吸附，振蕩試管并判定結果，若磁化紅細胞發生凝集，則為陽性反應;反 之，若磁化紅細胞不發生凝集，則為陰性反應。反應格局判定標準如下：
[0217]
[0218] 2.紅細胞不規則抗體檢測
[0219] 用已知血型的覆蓋我國臨床有意義紅細胞抗原的多人份0型紅細胞按上述具體實 施方式制備成磁化紅細胞，以替代新鮮紅細胞進行紅細胞不規則抗體檢測。
[0220] 檢測步驟如下：
[0221] (1)取潔凈試管，做好標記；
[0222] (2)加入待檢樣本(血清或血漿)50ul;
[0223] (3)加入上述磁化紅細胞50ul;
[0224] (4)混勻，室溫反應lmin;
[0225] (5)磁鐵吸附，振蕩試管并判定結果，若磁化紅細胞發生凝集（陽性反應），表明待 檢樣本中含有與該紅細胞抗原相對應的抗體，反之，若磁化紅細胞不發生凝集(陰性反應）， 表明待檢樣本中不含與紅細胞抗原對應的抗體。
[0226] 3.交叉配血
[0227] 用鮮血員紅細胞按上述【具體實施方式】制備成磁化紅細胞，以替代新鮮紅細胞進行 交叉配血。
[0228] 檢測步驟如下：
[0229] (1)取潔凈試管，做好標記；
[0230] (2)加入受血者(血清或血漿)50ul;
[0231] (3)加入鮮血員磁化紅細胞50ul;
[0232] (4)混勻，室溫反應lmin;
[0233] (5)磁鐵吸附，振蕩試管并判定結果，若磁化紅細胞發生凝集（陽性反應），表明待 檢樣本中含有與該紅細胞抗原相對應的抗體，配型不合;反之，若磁化紅細胞不發生凝集 (陰性反應），表明待檢樣本中不含與紅細胞抗原對應的抗體配型相合。
[0234] 試驗例2細菌磁顆粒負載抗紅細胞糖蛋白GPA單克隆抗體效果試驗
[0235] 選擇不同的偶聯劑，其余的方法按照實施例13的方法制備超順磁性功能顆粒，細 菌磁顆粒對抗紅細胞糖蛋白GPA單克隆抗體的負載效果見表1;
[0236] 表1不同偶聯劑對負載效果的影響r>[0237]
[0238] 選擇不同的孵育劑，其余的方法按照實施例14的方法制備超順磁性功能顆粒，細 菌磁顆粒對抗紅細胞糖蛋白GPA單克隆抗體的負載效果見表2;
[0239] 表2不同孵育劑對負載效果的影響
[0240]
[0241] 從表1中可看出，通過選擇4中不同的偶聯劑進行偶聯，抗紅細胞糖蛋白GPA單克隆 抗體的負載量可達到783yg/mg，當采用2或3種偶聯劑進行混合，或者采用本發明之外的偶 聯劑進行偶聯，細菌磁顆粒負載的抗紅細胞糖蛋白GPA單克隆抗體的量均顯著降低;從表2 中可以看出，當選擇不同殼聚糖和海藻酸鈉混合孵育劑時，可提高細菌磁顆粒對抗紅細胞 糖蛋白GPA單克隆抗體的負載量。
[0242] 選擇不同的處理條件，偶聯劑選自質量比為1:1.2:1:2.5的EDC、NHS、瓊脂和無水 硫酸鈣的混合物，孵育劑選自質量比為2:7.2的殼聚糖和海藻酸鈉的混合物，其余的步驟按 照實施例14的方法制備超順磁性功能顆粒，細菌磁顆粒對抗紅細胞糖蛋白GPA單克隆抗體 的負載效果見表3;
[0243] 表3不同處理步驟對負載效果的影響
[0244]
[0245] 從表3中可知，細菌磁顆粒的處理步驟對細菌磁顆粒對抗紅細胞糖蛋白GPA單克隆 抗體的負載效果具有很大的影響。
[0246] 試驗例3趨磁細菌MSR-1菌株擴大培養情況
[0247] 1)分組
[0248] 試驗1組:本發明實施例20所述的制備方法；
[0249] 對照1組:對照例1的制備方法；
[0250]對照2組:對照例2的制備方法；
[0251]對照3組:CN1952112公開的一種兼性厭氧趨磁細菌及其分離、純培養方法和細菌 磁顆粒的提取、純化方法中公開的培養方法；
[0252] 2)采用臺盼藍經典染色法對細胞進行計數，接種時細胞為IX 104個/ml，分別統計 原代細胞和擴大培養后的數量，結果見表4。
[0253]表4各組趨磁細菌MSR-1菌株體外培養擴增試驗結果
[0254]
[0255] 由表中可以看出，本發明提供的趨磁細菌培養方法可以有效的體外培養趨磁細菌 MSR_1菌株。
[0256] 以上所述僅為本發明的實施例，并非因此限制本發明的專利范圍，凡是利用本發 明說明書內容所作的等效結構或等效流程變換，或直接或間接運用在其它相關的技術領 域，均同理包括在本發明的專利保護范圍內。
【主權項】
1. 一種超順磁性功能顆粒，其特征在于，所述顆粒是由表面基團通過偶聯劑活化后的 細菌磁顆粒和抗紅細胞糖蛋白GPA單克隆抗體孵育而成。2. 如權利要求1所述的超順磁性功能顆粒，其特征在于，所述偶聯劑為質量比為1:1-1.2的EDC和NHS的混合物。3. 如權利要求1所述的超順磁性功能顆粒，其特征在于，所述孵育中加入重量份數比為 2:5.5-7.2的殼聚糖和海藻酸鈉的混合物作為孵育劑。4. 一種磁化紅細胞，其特征在于，所述磁化紅細胞是由權利要求1-3任意所述的超順磁 性功能顆粒與紅細胞孵育而成。5. 權利要求4所述的磁化紅細胞在臨床ABO血型抗體檢測、血型不規則抗體檢測篩查、 交叉配血或吸收放散實驗中的應用。6. -種權利要求1所述的超順磁性功能顆粒的制備方法，其特征在于，所述制備方法包 括如下步驟： a. 活化:加入偶聯劑對細菌磁顆粒進行活化，制得活化后的細菌磁顆粒； b. 孵育:將活化后的細菌磁顆粒與抗紅細胞糖蛋白GPA單克隆抗體，室溫孵育； c. 分離:磁鐵吸附，洗滌，即得超順磁性功能顆粒； 優選地，所述細菌磁顆粒先經過處理步驟再進行活化； 優選地，所述細菌磁顆粒的處理步驟具體方法如下： (1) 取細菌磁顆粒，加入處理劑攪拌條件下反應，反應完成后將產物洗滌至中性;所述 處理劑為體積比是40-60:1-3:0.3-1的無水乙醇、氨水和正硅酸乙酯的混合液； (2) 將步驟（1)反應后得到的細菌磁顆粒配成濃度為0.1%~0.3%的溶液，調節溶液pH 值至3.0-5.0，向上述溶液中加入濃度為5-15%的3-氨丙基三乙氧基硅烷乙醇溶液中，攪拌 條件下反應，反應完成后將產物洗滌至中性，制得經過處理的細菌磁顆粒； 優選地，所述活化步驟具體方法如下： (a)取經過處理的細菌磁顆粒，加入偶聯劑，攪拌反應，過濾，制得活化后的細菌磁顆 粒，所述偶聯劑為質量比為1:1-1.2的EDC和NHS的混合物； 優選地，孵育的條件為：140-160rpm渦旋振蕩，室溫，反應過夜； 優選地，步驟b的孵育過程還加入孵育劑，所述孵育劑為重量份數比為2: 5.5-7.2的殼 聚糖和海藻酸鈉的混合物。7. 如權利要求6所述的超順磁性功能顆粒的制備方法，其特征在于，所述細菌磁顆粒的 制備方法包括如下步驟： 1) 將趨磁細菌MSR-1菌株進行擴大培養； 2) 離心并收集趨磁細菌MSR-1菌株，用Tris-HCl緩沖液懸浮，得懸浮液； 3) 超聲波破碎懸浮液中的細胞； 4) 磁鐵吸附破碎后的細胞，靜置過夜，棄去上清，用磷酸鹽緩沖液重新懸浮吸附到的沉 淀，超聲波清洗，磁鐵再次吸附，棄上清，將吸附到的沉淀用磷酸鹽緩沖液懸浮，洗滌3次，即 得細菌磁顆粒； 優選地， 離心條件為:轉速8000-10000rpm，離心時間5-lOmin; 超聲波破碎條件為：超聲功率250-350?，超聲時間2-7s，間隔時間2-7s，超聲次數80- 100次，重復3次； 超聲波清洗條件為:超聲功率70-90w，超聲時間2-7s，間隔時間2-7s，超聲次數40-60 次。8. 如權利要求6所述的超順磁性功能顆粒的制備方法，其特征在于，所述抗紅細胞糖蛋 白GPA單克隆抗體的制備方法包括如下步驟： I用紅細胞糖蛋白GPA免疫小鼠； Π 取免疫后的小鼠，通過融合劑與雜交瘤細胞進行融合，將融合后的細胞懸浮于選擇 培養基中，進行培養； m抗紅細胞糖蛋白GPA單克隆抗體篩選； IV抗紅細胞糖蛋白GPA單克隆抗體的制備及純化。9. 如權利要求8所述的超順磁性功能顆粒的制備方法，其特征在于，所述融合劑為質量 比為5.6:1.2的聚乙二醇4000和聚乙二醇1500的混合物;所述選擇培養基由DMEM培養液和 懸浮溶質組成，所述懸浮溶質及其在DMEM培養液中的濃度為15-25μg/ml牛血清、15-20ng/ ηι?β-胡蘿卜素、l_3ng/ml丙酮酸鈉、5-10ng/ml維生素 E、5_10ng/ml多聚谷氨酸、2_5μg/ml殼 聚糖和25-30ng/ml堿性成纖維細胞。10. 如權利要求7所述的超順磁性功能顆粒的制備方法，其特征在于，所述趨磁細菌 MSR-1菌株擴大培養包括如下步驟： a. 在培養罐內加入第一培養基，105-110 °C滅菌lOmin，靜置lh后，將趨磁細菌MSR-1菌 株接種到培養罐中，進行第一次培養，獲得第一培養液;第一次培養的條件為:起始pH值為 5.5-6，培養溫度為28-30 °C，培養時間為3-5天，搖床轉速為250-300轉/分鐘，培養過程中通 入氧氣，通入氧氣的方式為：間隔20min，通入50min氧氣； b. 將第一培養液加入含有第二培養基的培養罐中，無氧狀態進行第二次培養;第二次 培養的條件為:起始pH值為6.5-7.0，培養溫度為20-25 °C，培養時間為2-3天，搖床轉速為 100-200轉/分鐘； 優選地， 所述第一培養基由重量份數為5-10份的谷氨酰胺、1-3份麥芽糖醇、2-5份、0.5-1份泛 酸鈣、0.5-1份酪蛋白酸鈉、0.2-0.5份磷酸二氫鉀、0.5-1份月桂酸肌氨酸和1-2份氯化鈉組 成； 所述第二培養基由重量份數為2-3份蛋白胨、2-5份生物素、1-2份甘氨酸、0.5-1份酒石 酸鈉、1-2份硝酸銨、1-2份磷酯酰絲氨酸和0.2-0.5份月桂醇硫酸酯鈉的組成。
【專利摘要】本發明提供一種超順磁性功能顆粒及磁化紅細胞，細菌磁顆粒表面天然帶有豐富的-NH2基團，通過一定的化學方法修飾使其活化并與抗紅細胞糖蛋白GP A單克隆抗體偶聯連接，制備成超順磁性功能顆粒；在臨床血型抗體檢測前，將其與紅細胞孵育并使其快速磁化，然后進行樣本檢測，檢測過程中，磁力分離取代離心力分離，可為臨床提供一種快速、簡便的試驗方法，并且提供的超順磁性功能顆粒特別有利于紅細胞快速磁化及臨床血型抗體檢測過程中固相-液相分離。
【IPC分類】G01N33/577, G01N33/80
【公開號】CN105699666
【申請號】CN201610052879
【發明人】張金菊, 王紅光
【申請人】北京中科圓融生物科技發展有限公司
【公開日】2016年6月22日
【申請日】2016年1月26日...