超順磁性功能顆粒、磁化紅細胞及其臨床應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于醫學檢驗領域，特別涉及超順磁性功能顆粒、磁化紅細胞及其臨床應 用。
【背景技術】
[0002] 紅細胞血型是人類遺傳多態型標志之一，自20世紀初發現ΑΒ0血型以來，已發現 500多個人類紅細胞血型抗原，目前已確認200多個。其中，與臨床最為密切的血型系統包括 AB0、Rh、MNS等29個系統。臨床血型血清學檢測主要有:血型檢測、抗體篩檢和鑒定、交叉配 血。目前，血型血清學檢測所使用的紅細胞均為新鮮紅細胞，在檢測過程中需要將紅細胞與 樣本反應，離心后才能觀察結果，然而離心時間較長，并且紅細胞離心后容易貼試管壁，不 利于觀察結果。
[0003] 趨磁細菌(Magnetotactic bacteria，MTB)是一類能沿磁力線方向排列或作定向 運動、在細胞內合成由生物膜包圍的細菌磁顆粒的革蘭氏陰性細菌，其在自然界普遍分布， 但是由于其對生長條件、營養要求非常苛刻，使得其純培養和特性的研究相當困難。在80年 代和90年代初期對趨磁細菌的研究一度處于低迷狀態。近年來，隨著分子生物學技術等的 迅速發展，對趨磁細菌的形態學、生物學特性、培養條件等的研究也迅速發展起來。
[0004] 趨磁細菌是從環境中吸收大量的鐵，形成一種特殊的細胞器，即細菌磁顆粒，其內 部含有一個單磁疇的四氧化三鐵(Fe30 4)或四硫化三鐵(Fe3S4)的晶體，其外部有脂類和蛋 白組成的單位膜包被。不同的菌株可以合成不同形狀的細菌磁顆粒，具有種專一性。細菌磁 顆粒主要有平截八面體、棱柱狀、子彈狀、箭頭狀、齒狀等，直徑30~120nm。在細胞內，細菌 磁顆粒通常高度有序地排列成一條或幾條鏈，形成一個或多個"小磁針"，從而使菌體可以 感知外界磁場;細菌磁顆粒的形成過程屬于生物礦化(biomineralization)，其整個過程多 在50nm左右的泡囊內進行，受到嚴格的生物調控，條件溫和，產物為單磁疇晶體，粒徑均一、 晶形穩定，在同類材料中磁性最強，是名副其實的"納米工廠(Nanofactory)"。同時，細菌磁 顆粒有單位膜包被，與裸露的磁性材料相比，其具有超順磁性，易于分散，目前尚無法人工 模擬。此外，細菌磁顆粒大小均勻、表面積大，并且外有生物膜包被，顆粒間不容易聚集，具 有良好的分散性和生物相容性。
[0005] 細菌磁顆粒是一種天然磁性納米生物材料，由于其優良的性能而在許多領域具有 巨大的潛在應用價值，例如CN102419370公開的用抗Bt殺蟲蛋白多克隆抗體包被的細菌磁 顆粒可用于檢測小鼠組織內Bt殺蟲蛋白；CN101077418公開的載阿霉素細菌納米細菌磁顆 粒可用于抑制癌細胞的增殖等;但是現有技術還沒有公開利用細菌磁顆粒與抗紅細胞糖蛋 白GPA單克隆抗體偶聯并用于血型抗體檢測的相關報道。
【發明內容】
[0006] 為了解決上述技術問題，本發明提供一種細菌磁顆粒及其磁化紅細胞，其可用于 檢測血型抗體，檢測方法簡便、高效，結果準確、可靠。
[0007] 本發明具體技術方案如下：
[0008] 本發明一方面提供一種超順磁性功能顆粒，其中該顆粒是由表面基團通過偶聯劑 活化后的細菌磁顆粒和抗紅細胞糖蛋白GPA單克隆抗體孵育而成。
[0009] 進一步的改進，該偶聯劑選自質量比為1:1-1.2的EDC和NHS的混合物。其中EDC為 1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺，NHS為N-羥基硫代琥珀酰亞胺，通過采用EDC和 NHS的混合物作為偶聯劑可以顯著提高細菌磁顆粒偶聯抗紅細胞蛋白GPA單克隆抗體的量。
[0010] 進一步的改進，為了進一步提高細菌磁顆粒的活化效果，上述偶聯劑中還加入了 質量比為1:2.5的瓊脂和無水硫酸鈣的混合物。
[0011] 進一步的改進，所述孵育中還加入重量份數比為2: 5.5-7.2的殼聚糖和海藻酸鈉 的混合物作為孵育劑。通過加入殼聚糖和海藻酸鈉的混合物作為孵育劑，可以顯著提高細 菌磁顆粒對抗紅細胞蛋白GPA單克隆抗體的負載量。
[0012] 本發明另一方面，還提供一種磁化紅細胞，該紅細胞是由超順磁性功能顆粒與紅 細胞孵育而成;本發明提供的超順磁性功能顆粒可與紅細胞共同孵育并使其快速磁化，然 后進行樣本檢測，檢測過程中，磁力分離取代離心力分離，可為臨床提供一種快速、簡便的 血型抗體檢測試驗方法。
[0013] 本發明另一方面提供的超順磁性功能顆粒和磁化紅細胞在臨床ΑΒ0血型抗體檢 測、血型不規則抗體檢測篩查、交叉配血或吸收放散實驗等中的應用。
[0014] 進一步的改進，超順磁性功能顆粒與紅細胞孵育過程還加入了重量份數比為2: 5.5-7.2的殼聚糖和海藻酸鈉的混合物作為孵育劑。
[0015] 本發明另一方面還提供一種細菌磁顆粒的制備方法，該制備方法包括如下步驟： [0016] a.活化:加入偶聯劑對細菌磁顆粒進行活化，制得活化后的細菌磁顆粒；
[0017] b.孵育:將活化后的細菌磁顆粒與抗紅細胞糖蛋白GPA單克隆抗體，室溫孵育；
[0018] c.分離:磁鐵吸附，洗滌，即得超順磁性功能顆粒。
[0019] 優選地，所述細菌磁顆粒先經過處理步驟再進行活化；
[0020] 優選地，所述細菌磁顆粒的處理步驟具體方法如下：
[0021 ] (1)取細菌磁顆粒，加入處理劑攪拌條件下反應，反應完成后將產物洗滌至中性； 所述處理劑為體積比是40-60:1-3:0.3-1的無水乙醇、氨水和正硅酸乙酯的混合液；
[0022] (2)將步驟(1)反應后得到的細菌磁顆粒配成濃度為0.1 %~0.3%的溶液，調節溶 液pH值至3.0-5.0，向上述溶液中加入濃度為5-15%的3-氨丙基三乙氧基硅烷乙醇溶液中， 攪拌條件下反應，反應完成后將產物洗滌至中性，制得經過處理的細菌磁顆粒；
[0023] 優選地，所述活化步驟具體方法如下：
[0024] (a)取經過處理的細菌磁顆粒，加入偶聯劑，攪拌反應，過濾，制得活化后的細菌磁 顆粒，所述偶聯劑為質量比為1:1-1.2的EDC和NHS的混合物；
[0025] 優選地，孵育的條件為:140-160rpm渦旋振蕩，室溫，反應過夜；
[0026] 優選地，步驟b的孵育過程還加入孵育劑，所述孵育劑為重量份數比為2: 5.5-7.2 的殼聚糖和海藻酸鈉的混合物。
[0027] 本發明另一方面還提供了 一種細菌磁顆粒的制備方法，其包括如下步驟：
[0028] 1)將趨磁細菌MSR-1菌株進行擴大培養；
[0029] 2)離心并收集趨磁細菌MSR-1菌株，用Tris-HCl緩沖液懸浮，得懸浮液；
[0030] 3)超聲波破碎懸浮液中的細胞；
[0031] 4)磁鐵吸附破碎后的細胞，靜置過夜，棄去上清，用磷酸鹽緩沖液重新懸浮吸附到 的沉淀，超聲波清洗，磁鐵再次吸附，棄上清，將吸附到的沉淀用磷酸鹽緩沖液懸浮，洗滌3 次，即得細菌磁顆粒。
[0032]優選地，細菌磁顆粒制備過程中，
[0033] 離心條件為:轉速8000-10000rpm，離心時間5-lOmin;
[0034] 超聲波破碎條件為:超聲功率250-350w，超聲時間2-7s，間隔時間2-7s，超聲次數 80-100次，重復3次；
[0035] 超聲波清洗條件為:超聲功率70-90w，超聲時間2-7s，間隔時間2-7s，超聲次數40-60次。
[0036]本發明另一方面還提供了抗紅細胞糖蛋白GPA單克隆抗體的制備方法，該方法包 括如下步驟：
[0037] I用紅細胞糖蛋白GPA免疫小鼠；
[0038] Π 取免疫后的小鼠，通過融合劑與雜交瘤細胞進行融合，將融合后的細胞懸浮于 選擇培養基中，進行培養；
[0039] ΙΠ 抗紅細胞糖蛋白GPA單克隆抗體篩選；
[0040] IV抗紅細胞糖蛋白GPA單克隆抗體的制備及純化。
[0041 ] 進一步的改進，融合劑為質量比為5.6:1.2的聚乙二醇4000和聚乙二醇1500的混 合物;選擇培養基由DMEM培養液和懸浮溶質組成，所述懸浮溶質及其在DMEM培養液中的濃 度為15_25μg/ml牛血清、15-2Ong/ml0-胡蘿卜素、l_3ng/ml丙酮酸鈉、5-10ng/ml維生素E、5_ 10ng/ml多聚谷氨酸、2_5μg/ml殼聚糖和25-30ng/ml堿性成纖維細胞。
[0042]本發明另一方面還提供了趨磁細菌MSR-1菌株擴大培養方法，其包括如下步驟： [0043] a.在培養罐內加入第一培養基，105-110°C滅菌lOmin，靜置lh后，將趨磁細菌MSR-1菌株接種到培養罐中，進行第一次培養，獲得第一培養液;第一次培養的條件為:起始pH值 為5.5-6,培養溫度為28-30 °C，培養時間為3-5天，搖床轉速為250-300轉/分鐘，培養過程中 通入氧氣，通入氧氣的方式為：間隔20min，通入50min氧氣；
[0044] b.將第一培養液加入含有第二培養基的培養罐中，無氧狀態進行第二次培養;第 二次培養的條件為:起始pH值為6.5-7.0，培養溫度為20-25°C，培養時間為2-3天，搖床轉速 為100-200轉/分鐘；
[0045] 優選地，
[0046] 所述第一培養基由重量份數為5-10份的谷氨酰胺、1-3份麥芽糖醇、2-5份、0.5-1 份泛酸鈣、0.5-1份酪蛋白酸鈉、0.2-0.5份磷酸二氫鉀、0.5-1份月桂酸肌氨酸和1-2份氯化 鈉組成；
[0047] 所述第二培養基由重量份數為2-3份蛋白胨、2-5份生物素、1-2份甘氨酸、0.5-1份 酒石酸鈉、1-2份硝酸銨、1-2份磷酯酰絲氨酸和0.2-0.5份月桂醇硫酸酯鈉的組成。
[0048] 本發明的有益效果在于細菌磁顆粒與裸露的磁性材料相比，易于分散、大小均勻、 表面積大，并且外有生物膜包被，顆粒間不容易聚集，具有良好的分散性、超順磁性和生物 相容性。將細菌磁顆粒偶聯抗紅細胞蛋白GPA單克隆抗體后，可更好直接牢固結合在紅細胞 上，這比普通磁顆粒非特異性吸附在紅細胞表面實現磁化細胞要更可靠，更加標準可控;進 一步與紅細胞進行孵化，可用于紅細胞的快速磁化，為臨床提供一種快速、簡便的血清學檢 測試驗方法。
【具體實施方式】
[0049] 下面將對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施 例僅是本發明的一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的實施例，本領域普通 技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其它實施例，都屬于本發明保護的范 圍。
[0050] 實施例1 一種超順磁性功能顆粒
[0051] 該顆粒是由表面基團通過偶聯劑活化后的細菌磁顆粒和抗紅細胞糖蛋白GPA單克 隆抗體孵育而成：
[0052] 該超順磁性功能顆粒的制備方法如下：
[0053] a.活化:加