一種石斛藥材的質量評價方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及中藥領域的藥材質量分析，具體涉及一種HPLC(高效液相色譜）指紋 圖譜法對各類石斛藥材的質量評價方法。
【背景技術】
[0002] 石斛是一種常用的滋補中藥，主要為石斛屬植物。石斛屬植物是蘭科植物中最大 的一個屬，包括鐵皮石斛、金釵石斛、密花石斛、鼓槌石斛等多個品種。在全球范圍內，約有 1100多種石斛，其中在我國發現的有76種。石斛的藥用價值歷史悠久。早在古代，石斛在 《神農本草經》中就被列為滋補上品，長久以來，隨著時代的發展，石斛一直被人們視為珍貴 的中草藥，具有十分重要的滋補功效。在臨床上，石斛被用于治療多種疾病，具有增強免疫 力、抗氧化、降血糖和抑制癌癥等藥理功效。由于人為長期無節制采挖及不合理利用石斛， 其野生資源日趨減少，市場上出現了一些以假亂真、以次充好的現象。此外，由于石斛產品 眾多，品質也參差不齊，其品種間的雜交使得其近緣的品種存在性狀交叉現象，分類區別比 較困難。目前對石斛藥材的質量評價局限于對個別或某幾類成分的評價，評價結果較片面， 不能從整體上進行評價秒，不能重復，很難推廣應用，因此，有必要尋找一種操作方便，高效 的測定方法對石斛鮮品、干品的藥材質量進行評價。
【發明內容】
[0003] 本發明的目的是提供一種石斛藥材的質量評價方法，解決對石斛藥材的質量評價 主要局限于對個別或某幾類成分的質量評價，其評價方式較片面，不能重復，不足以系統、 完整的表明石斛藥材整體質量的技術問題。
[0004] 本發明的目的是通過以下技術方案來實現，具體包括如下步驟：
[0005] ①對照品溶液的制備：精密稱取夏佛托苷，甲醇溶解稀釋即可。
[0006] ②標準樣品溶液的制備：取某一類不同批次的標準石斛藥材干燥樣品，粉碎，過 篩，精密稱取石斛粉末，加入水或一元醇溶解，室溫下超聲，過濾，濾液濃縮至干，再用甲醇 溶解，容量瓶中定容，搖勻，微孔濾膜過濾，即得該類石斛藥材的標準樣品溶液；
[0007] ③石斛藥材HPLC指紋圖譜的建立：Alltima(：18色譜柱；二極管陣列檢測器；流 動相為乙腈/乙酸一乙酸銨溶液，梯度洗脫；檢測波長為280±10nm;柱溫25-35°C;流速 0. 8-1. 2ml/min;在此條件下分析該類標準樣品溶液，得到該類石斛藥材的指紋圖譜；
[0008] ④標準指紋圖譜的建立：以對照樣品夏佛托苷色譜峰作為指紋圖譜的參照峰，計 算該類標準石斛樣品各特征峰的相對保留時間和保留峰面積，制定得到該類石斛的標準指 紋圖譜；
[0009] ⑤供試樣品溶液的制備：取供試石斛藥材干燥樣品，粉碎，過篩，精密稱取石斛粉 末，加入水或一元醇溶解，室溫下超聲，過濾，濾液濃縮至干，再用甲醇溶解，容量瓶中定容， 搖勻，微孔濾膜過濾，即得供試樣品溶液；
[0010] ⑥石斛藥材質量評價：按照步驟③測定供試樣品的指紋圖譜，以供試樣品指紋圖 譜中的特征峰的相對保留時間和保留峰面積與該類標準指紋圖譜對比，相似度> 0. 85的 為該類質量好的石斛藥材，相似度< 〇. 6的為該類石斛藥材的劣質品或是其他種類的石斛 藥材。
[0011] 進一步地，步驟①中所述的對照樣品溶液制備過程為：精密稱取夏佛托苷作為對 照品，用75 %甲醇（V水：V甲醇=25:75)溶解稀釋，制備成濃度為16. 4μg/ml夏佛托苷溶 液即為對照品溶液；
[0012] 進一步地，步驟①中所述的標準樣品溶液的制備過程為：分別取該類不同批次 的標準石斛干燥樣品，用粉碎機粉碎，過篩，得石斛粉末，精密稱取石斛粉末1. 〇〇〇g，置于 10〇1111錐形瓶中，加入5〇1^75%甲醇（￥水：￥甲醇=25 :75)，室溫下超聲3〇1^11后取出，過 濾，濾液旋蒸濃縮至干，用75%甲醇溶劑（V水：V甲醇=25:75)溶解，然后轉移至5ml容量 瓶中定容，搖勻，以0. 45μm微孔濾膜過濾，即得該類不同批次的標準石斛樣品溶液；
[0013] 進一步地，步驟①中所述的供試樣品溶液的制備過程為：取供試干燥樣品，用粉 碎機粉碎，過篩，得石斛粉末，精密稱取石斛粉末1. 〇〇〇g，置于l〇〇ml錐形瓶中，加入50mL 75%甲醇（V水：V甲醇=25:75)，室溫下超聲30min后取出，過濾，濾液旋蒸濃縮至干，用 75%甲醇溶劑（V水：V甲醇=25:75)溶解，然后轉移至5ml容量瓶中定容，搖勻，以0. 45μm 微孔濾膜過濾，即得供試樣品溶液；
[0014] 進一步地，精密稱取石斛粉末的稱量誤差<0. 2%;
[0015] 進一步地，過篩為過孔徑0· 335mm的篩；
[0016] 進一步地，溶解加入的一元醇為甲醇或乙醇；
[0017] 進一步地，室溫超聲時間為10_40min;
[0018] 進一步地，步驟③中采用高效液相色譜儀進行測定的色譜條件與系統適用性實驗 為：色譜柱：AlltimaC18 色譜柱（250mmX4. 6mm，5um);流速：1. 0ml/min;柱溫：30°C;進樣 量：20ul;檢測波長：280nm，參比波長500nm;流動相：包括流動相A和流動相B，流動相A為 0. 4%乙酸+20mmol/L乙酸銨水溶液，流動相B為乙腈，并按一定的洗脫梯度進行洗脫，理論 板數按夏佛托苷計算，應不低于10000。
[0019] 進一步地，步驟②中所述標準石斛為鐵皮石斛、霍山石斛、兜唇石斛、齒瓣石斛、金 釵石斛、疊鞘石斛、鼓槌石斛、環草石斛以及流蘇石斛中的任意一種。
[0020] 進一步地，所述石斛的標準指紋圖譜中含有11個特征峰，其中一個為夏佛托苷對 照品的特征峰。該石斛的標準指紋圖譜中的11個特征峰的保留時間分別為：10. 83min、 13. 01min、21. 22min、24. 15min、27. 84min、28. 80min、43. 32min、44. 64min、52. 67min、 56. 37min以及66. 15min，其中，保留時間為24. 15min的峰為夏佛托苷對照品的特征峰； 該保留時間的誤差一般在±0. 3min內，即該石斛的標準指紋圖譜中的11個特征峰的 保留時間分別可能為 10. 83±0· 3min、13. 01±0· 3min、21. 22±0· 3min、24. 15±0· 3min、 27. 84±0. 3min、28. 80±0. 3min、43. 32±0. 3min、44. 64±0. 3min、52. 67±0. 3min、 56. 37±0. 3min以及 66. 15±0. 3min。
[0021] 進一步地，所述洗脫梯度如下所示：
[0022] 時間（min) A相濃度B相濃度（％:) 〇 y.%. .2： 1:2: Μ 15 35 76 24 4S 36 60 IS 75 10 5 95 〇
[0023] 本發明提供了一種石斛特征指紋圖譜的建立方法，其主要具有的有益效果為：與 過去的指紋圖譜相比，本發明方法具有如下顯著的優點和用途：本發明選用夏佛托苷為對 照峰，對石斛中的其他特征峰進行保留時間和峰面積歸一化處理，扣除不同批次之間保留 時間漂移、操作誤差等影響；本發明在構建指紋圖譜的方法中對相對峰面積大于5%的指 紋特征峰進行了定性，突破了以往指紋圖譜的過于模糊性，對指紋圖譜的主要成分進一步 明確，將石斛指紋圖譜的整體性和成分特異性統一起來，從而可以應用于藥用石斛的石斛 組培苗、石斛鮮品、石斛干品的質量分級及真偽鑒別。具體地：
[0024] ①本發明所述方法的重現性良好，各共有峰相對峰面積的RSD小于5%，相對保留 時間小于1% ;精密度實驗中各共有峰相對峰面積的RSD小于5%，相對保留時間小于1%， 樣品在24小時之內穩定性良好。說明各共有色譜峰能夠客觀地反映石斛的內在品質，可以 作為石斛的質量控制性指標。
[0025] ②本發明建立的特征指紋圖譜檢測方法對各供試品的前處理方法簡單，特征性成 分保留完整，且供試樣品溶液穩定性良好；
[0026] ③該高效液相色譜方法的精密度較高、重現性良好，分析時間較短，具有一定的專 屬性，所得指紋圖譜中各指紋峰分離效果較好；
[0027] ④本發明選用峰面積較大的共有峰作為特征指紋峰，通過特征指紋峰相對保留時 間和相對峰面積的比較，能有效地表征藥用石斛的質量；
[0028] ⑤本發明所建立的特征指紋圖譜以夏佛托苷對照品為參照峰，確保各特質指紋峰 的相對穩定性。
[0029] 目前我國對石斛的質量評價主要局限于對個別或某幾類成分的質量評價，其評價 方式較片面，不足以系統、完整的表明石斛藥材的整體質量，急需探索更先進、更有效的質 量評價方法。而高效液相特征指紋圖譜對鑒別石斛藥材和含有石斛藥材的復方制劑的質量 具有重要意義，且建立一種能較全面的質量評