，最終BW質量濃度為2. 06mg/mL。
[0113] ⑵接收液的制備：20%乙醇水溶液，使用前37°C預熱并超聲除去氣泡。
[0114] 2. 2. 3體外透皮吸收試驗用實施例1~13中方法制備脂質體人工皮膚膜，每種方 法平行制備2份；采用改良Franz擴散池（擴散面積為3. 14cm2,接收室體積為7. OmL)進行 透皮實驗，將脂質體人工皮膚膜/離體腹部皮膚固定于擴散池上，角質層向上，接收室加入 接收液，將裝好膜/皮膚與接收液的擴散池放入透皮擴散儀，37°C，500r/min，平衡lh。精密 量取BW混懸液2. OmL于供給室；在12h吸取0. 2mL接收液，接收液樣品用甲醇稀釋，加入內 標物木糖醇，19 000r/min離心10min，精密量取上清液100 μ L，進行UPLC-MS/MS分析。
[0115] 2. 3 UPLC-MS/MS 條件
[0116] 2. 3. 1液相條件色譜柱為Hibar HR (：18柱（100_Χ2· lmm，2ym);流動相為乙 臆-〇· 1 %甲酸水溶液。0~Imin，10%乙臆；1~5min，10%~30%乙臆；5~6min，30%~ 75%乙腈；6~8111；[11，75%~10%乙腈；8~11111；[11，10%乙腈；體積流量0.41]117 /111；[11;進樣體 積4 μ L ;柱溫35°C。
[0117] 2. 3. 2質譜條件離子源：ESI源；掃描方式：多反應監測（MRM)方式汽化管溫度： 450°C ;毛細管溫度：350°C ;噴霧電壓：負離子（3500V)，正離子（3184V)。
[0118] 2. 4模式識別分析采用實施例1~13制備所得脂質體人工皮膚膜、市售Start-M 膜，及大鼠皮為膜材按"2. 2"項下方法進行BW透皮實驗，再按"2. 3"項下方法對接受液進 行質譜分析，所得總離子流圖采用解卷積，并以同一保留時間下同一質荷比的峰視為同一 種化合物，化合物峰面積均采用內標歸一化方法進行數據標準化處理，最后采用偏最小二 乘判別法（PLS-DA)模型，對脂質體人工皮膚膜組、市售Start-M膜組，及大鼠皮組透過數據 進行多維統計分析，分析結果用得分圖（score plot)表示（圖4)。
[0119] 擬合所得模型包含2個主成分，其擬合參數為R2X = 92. 7%，Q2 = 95. 4%，說明 模型的穩定性和預測率較高。由圖4可見，脂質體人工皮膚膜組距大鼠皮組更近，而市售膜 組距大鼠皮組較遠，說明BW經脂質體人工皮膚膜透皮后的成分群與經大鼠皮透皮后的成 分群相近，而BW經市售Start-M膜透皮的成分群與大鼠皮有著顯著差異。由此模擬多成分 同時透過膜的透過效果，可見脂質體人工皮膚膜與大鼠皮的透過行為更為相似。
[0120] 實施例20 :脂質體人工皮膚膜的紅外測定
[0121] 脂質體人工皮膚膜1和2分別按實施例1和6方法制備。
[0122] 檢測方法：傅里葉變換衰減全反射紅外光譜（ATR-FTIR)
[0123] 儀器型號：光譜儀FTIR-230,采樣附件ATR-500/M
[0124] 實驗步驟：取適宜大小的大鼠皮，脂質體人工皮膚膜1，脂質體人工皮膚膜2和市 售Strat-M膜，將測試面直接放在鍺晶體上，旋轉OMNI采樣器固定鈕，壓住樣品。硒化鋅作 為發生全反射的晶體材料，入射光角度為45°，掃描范圍為4000cm 1~650cm \分辨率4為 cm \掃描次數為64。結果如圖5所示，角質層特征峰波數如表6所示，可見，脂質體人工皮 膚膜1和2的紅外吸收光譜更接近于真實大鼠皮。
[0125] 表6紅外特征吸收峰的波數（特征峰/cm 3
[0127] 以上所有實施例中市售Strat-M人工皮膚膜均采購于默克密理博（Merck Millipore)公司。
【主權項】
1. 一種脂質體人工皮膚膜，其特征在于：包含兩種粒徑不同的脂質體，1份過孔徑為 800 nm聚碳酸酯膜的脂質體，1~10份過孔徑為400 nm聚碳酸酯膜的脂質體。2. 如權利要求1中所述脂質體人工皮膚膜，其特征在于：所述脂質體采用磷脂材料制 備所得，其中磷脂材料為重量比為1~8 : 1 : 0.2 : 0.6 : 2的卵磷脂，膽固醇，膽固醇硫 酸酯、神經酰胺、棕櫚酸。3.如權利要求1中所述脂質體人工皮膚膜，其特征在于：所述脂質體采用磷脂材料制 備所得，其中磷脂材料為重量比為8:1~1:1的卵磷脂和膽固醇。4.如權利要求1中所述脂質體人工皮膚膜，其特征在于：所述脂質體采用磷脂材料制 備所得，其中磷脂材料為卵磷脂。5.如權利要求1~4中任一項所述脂質體人工皮膚膜，其特征在于：所述兩種粒徑不同 的脂質體，其組成為1份過孔徑為800 nm聚碳酸酯膜的脂質體，2份過孔徑為400 nm聚碳 酸酯膜的脂質體。6.如權利要求1~4中任一項所述脂質體人工皮膚膜，其特征在于：所述兩種粒徑不同 的脂質體分層鋪于多孔膜上。7.如權利要求5中所述脂質體人工皮膚膜，其特征在于：所述兩種粒徑不同的脂質體 分層鋪于多孔膜上。8.權利要求1~7中任一項所述脂質體人工皮膚膜的制備方法，包括脂質體的制備、多 孔膜與嵌套底部的密封、脂質體與多孔膜的結合、凍融循環步驟。9.如權利要求8中所述脂質體人工皮膚膜的制備方法，其特征在于：所述脂質體采用 被動載藥法或主動載藥法制備所得，其中被動載藥法選自超聲分散法、冷凍干燥法、復乳 法、注入法、反相蒸發法、超臨界法；主動載藥法選自pH梯度法、硫酸銨梯度法、醋酸鈣梯度 法。10. 如權利要求8中所述脂質體人工皮膚膜的制備方法，其特征在于：所述脂質體采用 薄膜分散法制備所得。11. 如權利要求8~10中任一項所述脂質體人工皮膚膜的制備方法，其特征在于：包括 如下步驟： 脂質體的制備：稱取作膜材用的磷脂材料5~10份，溶于50~120份無水乙醇或體積比為2:1的氯仿-甲醇混合溶液；減壓蒸發除去溶劑，形成薄膜；再用50~120份含有5~15%乙 醇的磷酸鹽緩沖溶液室溫水合，得到脂質體混懸液；最后將脂質體混懸液分別擠壓過孔徑 為400 nm和800 nm的聚碳酸酯膜，得到兩種粒徑的脂質體； 多孔膜與膜嵌套底部的密封：將膜嵌套底部原有的膜去掉，將孔徑為〇.45 μ m的尼龍 膜和膜嵌套底部150 °C加熱，使多孔膜與嵌套底部形成完全密封的小室； 脂質體與多孔膜的結合：將步驟1)制備所得過孔徑400 nm聚碳酸酯膜的脂質體1份， 加入到步驟2)制得的嵌套中，2000 rpm離心10 min;將嵌套版旋轉180°，再次加入步驟 1)制備所得過孔徑400 nm聚碳酸酯膜的脂質體1份，2000 rpm離心10 min;然后將膜置 于干燥箱中50 °C加熱至干燥；最后加入步驟1)制備所得過孔徑800 nm聚碳酸酯膜的脂 質體1份，2000 rpm離心10 min，去除上清液，制得脂質體人工皮膚膜初品； 凍融循環：將步驟3)制備所得脂質體人工皮膚膜初品置于-70~-120 °C冷凍0.5~1 h， 取出后50~75 °C加熱0. 5~1 h，如此循環凍融2~3次，即得脂質體人工皮膚膜。
【專利摘要】離體動物皮膚被廣泛應用于外用制劑的體外透皮實驗，但動物皮膚因種屬、個體、部位、年齡、性別等因素導致差異，實驗可控性和重現性不佳，且存在一定倫理學問題；而市售人工皮膚膜與真實皮膚的擬合度較低，導致實驗結果可信度不高；鑒于此，本發明提供一種脂質體人工皮膚膜，其基于脂質體技術模擬皮膚角質層的組成和結構；制備方法包括脂質體制備、多孔膜與嵌套底部密封、脂質體與多孔膜結合、凍融循環等步驟。實驗證實用本發明提供的脂質體人工皮膚膜透過不同極性藥物成分，其透過行為與真實皮膚類似，且模擬程度優于市售人工皮膚膜，表明其能替代真實皮膚用于體外透皮吸收實驗，為外用制劑、化妝品的研發提供有力的技術保障。
【IPC分類】G01N13/04
【公開號】CN105300848
【申請號】CN201510818671
【發明人】陳軍, 張會, 許海恒, 張夢盼, 葛恒菊, 湯清涵, 史玉婷, 張敏, 顧薇
【申請人】南京中醫藥大學
【公開日】2016年2月3日
【申請日】2015年11月23日