修飾的糖通過突變體半乳 糖轉移酶與末端GlcNAc殘基連接。
84. 根據權利要求83所述的方法，其中所述突變體半乳糖轉移酶是Y289L突變體半乳 糖轉移酶。
85. 根據權利要求65、68或69所述的方法，其中所述化學手柄包括疊氮基團，所述反應 性基團包括末端三芳基膦、末端炔烴或活化炔烴基團；或者所述化學手柄包括末端三芳基 膦、末端炔烴或活化炔烴基團，所述反應性基團包括疊氮基團。
86. 根據權利要求85所述的方法，其中所述活化炔烴包括二苯并環辛炔基團。
87. 根據權利要求65、68或69所述的方法，其中所述化學手柄包括狄爾斯-阿爾德二 烯，所述反應性基團包括狄爾斯-阿爾德親雙烯體；或所述化學手柄包括狄爾斯-阿爾德親 雙烯體，所述反應性基團包括狄爾斯-阿爾德二烯。
88. 根據權利要求65、68或69所述的方法，其中所述化學手柄包括帶羰基的直鏈或支 鏈C「C12碳鏈，所述反應性基團包括-NRiNH2 (酰肼）、-順1(C= 0)NR2NH2 (氨基脲）、-順1(C= S)NR2NH2 (氨基硫脲），-(C= 0)NR1^ (羰基酰肼），-(C=S)NR1^ (硫代羰基酰肼）、-(S02) NR1% (磺酰肼）、-NRWR2(C= 0)NR3NH2 (卡巴肼）、-NRWR2(C=S)NR3NH2 (硫代卡巴肼） 或_〇NH2 (氨氧基），其中每個R1、R2和R3獨立地是H或含1-6個碳原子的烷基。
89. 根據權利要求65、68或69所述的方法，其中包括化學手柄的所述的經過修飾的糖 是UDP-GalNAz。
90. 根據權利要求65、68或69所述的方法，其中所述金屬離子螯合劑包括選自以下基 團的基團：1，4,8，11-四氮雜二環[6.6.2]十六烷-4，11-二基）二乙酸化81￡24);去鐵 胺；二亞乙基三胺五乙酸0>TPA) ;1，4,7，10-四氮雜環十四烷-1，4,7，10-四乙酸（0(^八）； 乙二胺四乙酸（EDTA);乙二醇雙（2-氨乙基醚）-N，N，N'，N' -四乙酸（EGTA) ;1，4,8， 11-四氮雜環十四烷-1，4,8，11-四乙酸〇^了4);乙烯二-(2-4羥基-苯基甘氨酸）伍即6); 5-C1-EHPG;5-Br-EHPG;5-Me-EHPG;5t-Bu-EHPG;5_ 仲-Bu-EHPG;苯并二亞乙基三胺五乙 酸（苯并-DTPA);二苯并-DTPA;苯基-DTPA;二苯基-DTPA;芐基-DTPA;二芐基-DTPA; 雙_2_(羥基芐基）-乙二胺二乙酸（HBED)及它們的衍生物；Ac-DOTA;苯并-D0TA;二苯 并-D0TA;N0TA(1，4,7-三氮雜環壬烷N，N'N"-三乙酸）；苯并-N0TA;苯并-TETA;苯 并-D0TMA，其中D0TMA是1，4,7，10_四氮雜環十四烷_1，4,7，10_四（甲基四乙酸）；苯 并-TETMA，其中TETMA是1，4,8，11_四氮雜環十四烷-1，4,8，11-(甲基四乙酸）；1，3_丙 二胺四乙酸帥了4)的衍生物 ；三亞乙基四胺六乙酸〇7擬）；1，5，10，^4"-三（2,3-二 羥基苯甲酰基）-三兒茶酚鹽的衍生物仏扣41);及1，3,54州'，^'-三（2,3-二羥基苯甲 酰基）氨基甲基苯（MECAM)。
91. 根據權利要求65、68或69所述的方法，其中所述金屬離子螯合劑基團包括去鐵胺。
92. 根據權利要求65、68或69所述的方法，其中所述金屬離子螯合劑基團包括由下述 結構表示的單元：
93. 根據權利要求65、68或69所述的方法，其中所述標記分子是DIB0-DF0。
94. 根據權利要求65、68或69所述的方法，其中步驟（c)是在基本上不含蛋白酶的溶 液中進行的。
95. 根據權利要求65、68或69所述的方法，其中所述放射性金屬離子選自 45Ti、51Mn、52Mn、52mMn 52Fe、6〇Cu、61Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、72AS、86Y、89Zr、94mTC、 99mTC、n〇In、mIn、113Ir^P177Lu。
96. 根據權利要求65、68或69所述的方法，其中所述樣品選自受試者、受試者的組織、 受試者的細胞及受試者的體液。
97. 根據權利要求96所述的方法，其中所述受試者是哺乳動物。
98. 根據權利要求65、68或69所述的方法，其中檢測放射性發射是采用正電子發射斷 層掃描法完成的。
99. 一種檢測受試者中細胞相關抗原存在的方法，所述方法包括以下步驟： (a) 提供包含帶Gal-GlcNAc鍵的低聚糖并能識別細胞相關抗原的抗體； (b) 提供裂解Gal-GlcNAc鍵的0 -半乳糖苷酶； (c) 使抗體與0 -半乳糖苷酶接觸，提供包含末端GlcNAc殘基的抗體； (d) 提供UDP-GalNAz; (e) 提供半乳糖轉移酶Y289L突變體； (f) 使含末端GlcNAc殘基的抗體與UDP-GalNAz及半乳糖轉移酶Y289L突變體接觸，其 中UDP-GalNAz的GalNAz基團連接到末端GlcNAc殘基上，提供一種經過修飾的抗體； (g) 提供DIBO-DFO; (h) 使經過修飾的抗體與DIBO-DFO接觸，其中DIBO-DFO連接到GalNAz基團上，提供一 種標記抗體； (i) 提供放射性金屬離子； (j) 使標記抗體與放射性金屬離子接觸，其中所述金屬離子與螯合劑基團締合，提供放 射性標記的抗體； (k) 提供受試者； (l) 給受試者施用放射性標記的抗體；及 (m) 檢測放射性標記抗體的放射性發射，其中檢測到的發射與受試者的細胞相關性抗 原的出現呈相關性。
100. 根據權利要求99所述的方法，其中所述標記分子進一步包括熒光團。
101. 根據權利要求1〇〇所述的方法，其中所述熒光團選自香豆素、花青、苯并呋喃、喹 諾酮、喹唑啉、11引哚、氮諱、borapolyazaindacine(硼多氮雜諱淆）和氧雜蒽，氧雜蒽包括突 光素、羅丹明和對甲氨基酚。
102. 試劑盒，包括： 包含化學手柄的改性糖； 包括金屬離子螯合劑基團和反應性基團的標記分子；或 包括金屬離子螯合劑基團、反應性基團和熒光團的標記分子； 在權利要求1、27、65或99所述方法中使用的說明。
103. 試劑盒，包括： 包含化學手柄的改性糖； 包括金屬離子螯合劑基團和反應性基團的第一個標記分子； 包含熒光團和反應性基團的第二個標記分子； 在權利要求30、31、68或69所述方法中使用的說明。
104. -種具有下述分子式的標記分子： 熒光團-反應性基團-金屬離子螯合劑 其中， 熒光團是香豆素、花青、苯并呋喃、喹諾酮、喹唑啉、吲哚、氮茚、borapolyazaindacine(硼多氮雜諱烯）或氧雜蒽； 反應性基團包括末端三芳基膦、炔烴、末端炔烴、活化炔烴基團、疊氮化物、酮、酰肼、氨 基脲、硫代羰基酰肼、羰基酰肼、磺酰肼、卡巴肼、硫代卡巴肼或氨氧基、狄爾斯-阿爾德二 烯、狄爾斯-阿爾德親雙烯體；及 金屬離子螯合劑是1，4,8,11-四氮雜二環[6. 6. 2]十六烷-4,11-二基）二乙酸 (CB-TE2A);去鐵胺；二亞乙基三胺五乙酸（DTPA) ;1，4,7，10-四氮雜環十四烷_1，4,7， 10-四乙酸（DOTA);乙二胺四乙酸（EDTA);乙二醇雙（2-氨乙基醚）-N，N，N'，N' -四乙酸 (EGTA) ;1，4,8，11-四氮雜環十四烷-1，4,8，11-四乙酸（TETA);乙烯二-(2-羥基-苯基 甘氨酸）（EHPG) ;5-Cl-EHPG;5-fc-EHPG;5-Me-EHPG;5t-Bu-EHPG;5-仲-Bu-EHPG;苯并二 亞乙基三胺五乙酸（苯并-DTPA);二苯并-DTPA;苯基-DTPA;二苯基-DTPA;芐基-DTPA; 二芐基-DTPA;雙-2-(羥基芐基）-乙二胺二乙酸（HBED)及它們的衍生物；Ac-DOTA;苯 并-D0TA;二苯并-D0TA;1，4,7_三氮雜環壬烷N，N'N"-三乙酸（N0TA);苯并-N0TA;苯 并-TETA;苯并-D0TMA，其中D0TMA是1，4,7，10_四氮雜環十四烷_1，4,7，10_四（甲基四 乙酸）；苯并-TETMA，其中TETMA是1，4,8，11_四氮雜環十四烷-1，4,8，11-(甲基四乙酸）； 1，3_丙二胺四乙酸（PDTA)的衍生物；三亞乙基四胺六乙酸（TTHA) ;1，5，10-N，N'，N"-三 (2,3-二羥基苯甲酰基）-三兒茶酚鹽的衍生物仏扣六1);及1，3,5，，^，^'-三（2,3-二 羥基苯甲酰基）氨基甲基苯（MECAM)。
【專利摘要】本發明提供了用于糖蛋白位點特異性標記中使用的方法、組合物和試劑盒，包括酶介導摻入包含化學手柄的經過修飾的糖及含反應性基團、金屬離子螯合劑與/或熒光團的標記分子的環加成反應化學。
【IPC分類】G01N33-50
【公開號】CN104704359
【申請號】CN201380037061
【發明人】B.阿紐, R.阿格勒, H.C.康, 陳愛梅, K.吉
【申請人】生命科技公司
【公開日】2015年6月10日
【申請日】2013年10月25日
【公告號】EP2912459A2, US20150246146, WO2014066733A2, WO2014066733A3