糖蛋白酶介導位點特異性放射性標記的方法和組合物的制作方法
【專利說明】
[0001] 相關應用
[0002] 本申請享有于2012年10月25日提交的美國臨時申請61/718, 562號的利益，該 專利公開的內容通過引用而納入到本申請中。
技術領域
[0003] 本發明涉及糖蛋白位點特異性放射性標記領域。
[0004] 發明背景
[0005] 抗體顯著的特異性、親和力和穩定性使其成為向腫瘤輸送診斷性和治療性放射性 同位素的極有前景的載體。實際上，在過去二十年內，攜帶放射性核素 124I、mIn，及64Cu的 用于PET及SPECT成像的抗體，以及攜帶放射性核素9°Y、mLu，和225Ac的用于放射治療的抗 體已經在臨床中得到應用。
[0006] 但是，放射性免疫偶聯物的開發和轉化潛在的一種局限性是抗體放射性標記缺乏 位點特異性。絕大多數抗體放射性標記方法依賴于與氨基酸殘基的反應，典型的氨基酸是 用于放射性碘標記的酪氨酸或用于放射性金屬螯合劑偶聯的賴氨酸或半胱氨酸。而且，抗 體當然是非常大的分子，因此，抗體具有每種氨基酸的多個復制氨基酸。因此，無法精確控 制抗體上放射性核素或放射性金屬_螯合劑絡合物的特異性分子位置。
[0007] 缺少放射性標記位點特異性，給放射性免疫偶聯物的開發和使用帶來了兩種主要 的復雜性。首先，不能控制抗體上的放射性標記的精確位置，放射性同位素或放射性金屬螯 合物最后可能是附加到抗體的抗原結合區，對構建體的免疫反應性造成不利影響。其次，不 了解放射性標記的準確位置，得到的放射性免疫偶聯物在某種程度上未適當地進行化學定 義，這在基礎科學研究中（也許更重要的是在臨床管理審查和批準過程中）是一個問題。
[0008] 此外，缺乏由直接標記反應或螯合劑偶聯策略所提供的重現性，對于目前放射性 免疫偶聯物的構建策略來說，是另一個令人煩惱的局限性。鑒于大多數放射性標記方法的 非位點選擇性性質，為了取得能在最終的放射性免疫偶聯物的特異性活動及其免疫反應性 之間實現適當平衡的標記度，每種新的免疫所偶聯物都必須開展廣泛的優化，這是一個非 常耗時費力且成本高昂的過程。此外，反應性化學偶聯試劑本身，傾向于在化學上不穩定， 易于水解，因此，需要在氬或氮氣惰性氛圍中貯存，在重復使用時會導致結合重現性差的問 題。
[0009] 光學成像是PET的很有價值的補充手段，特別是作為腫瘤切除術的視覺輔助手 段。對體內應用來說，在近紅外（NIR，700-900nm)區成像最佳，因為在此區域所有生物分子 的吸收光譜都達到最低，為小型動物研究及各種人類臨床情況（例如，乳腺成像、內窺鏡檢 查、手術指導等）提供了一個清楚的光學窗口。在NIR窗口中，除組織光穿透更好以外，組 織自體熒光也顯著減少。雙重標記成像在其中尤其有用的一個有價值的臨床應用是通過首 先使用全身PET成像來確定腫瘤的位置，然后，采用近紅外光（NIRF)成像來引導腫瘤切除 術。此外，采用各波長全光譜的熒光染料可用于對組織表面上的腫瘤成像，例如，對胃腸系 統中、皮膚上或眼睛中的腫瘤成像。
[0010] 與光學成像探針的標準偶聯存在同樣的非位點選擇性和重現性差的缺點，尤其是 從抗體至抗體。此外，利用光學成像探針和放射性標記探針的雙偶聯方法涉及到各輪抗體 偶聯反應的并聯或串聯，讓這些問題更加棘手。例如，確定螯合物與NIR染料的偶聯的正確 平衡，要求進行幾輪優化，以確定每個檢測探針的最佳標記度，同時，保持抗體結合親和力， 對于每種新的免疫偶聯物來說，這是一個需要重復的過程。因此，當使用標準偶聯技術時， 由于保持抗原結合親和力的要求，無法總是達到最佳標記度。
[0011] 為了解決這些問題，人們在建立抗體的位點特異性放射性標記方法方面做出了種 種努力。除少數例外以外，這些策略都依賴經特別設計而攜帶反應性硫醇單元或融合蛋白 的抗體；但是，使用基因工程抗體增加了過多的復雜性及費用，阻礙了系統臨床轉化的模塊 性和潛力。因此，需要一種穩健可靠的、不需要特殊抗體工程的糖蛋白和抗體的位點選擇性 放射性標記方法。
【發明內容】
[0012] 本發明提供了一種用于糖蛋白位點特異性標記的方法、組合物和試劑盒，包括酶 介導摻入含化學手柄的經過修飾的糖和標記分子的環加成反應化學的組合，標記分子包 含：金屬離子螯合劑基團及與經過修飾的糖的化學手柄相連的反應性基團；熒光團及與經 過修飾的糖的化學手柄相連的反應性基團；或金屬離子螯合劑、與經過修飾的糖的化學手 柄相連的反應性基團及熒光團。在某些實施例中，糖蛋白包括末端GIcNAc殘基。在某些實 施例中，糖蛋白是抗體或Fc融合蛋白。在某些實施例中，抗體是IgA、IgE、IgD、IgG、IgM或 IgY。在某些實施例中，抗體具有細胞相關抗原親和力。在某些實施例中，末端GlcNAc殘基 位于抗體的Fc區域。
[0013] 在某些實施例中，提供了標記糖蛋白的方法，所述方法包括：
[0014] a)提供一種包含末端GlcNAc殘基的糖蛋白；
[0015] b)提供一種包含化學手柄的經過修飾的糖；
[0016] c)使糖蛋白與經過修飾的糖接觸，其中所述的經過修飾的糖與末端GlcNAc殘基 連接，提供修飾糖蛋白；
[0017] d)提供包括金屬離子螯合劑基團和反應性基團的標記分子；
[0018] e)使修飾糖蛋白與標記分子接觸，其中所述反應性基團與化學手柄連接，提供標 記糖蛋白；
[0019] f)提供放射性金屬離子；及
[0020] g)使標記糖蛋白與放射性金屬離子接觸，其中所述金屬離子與螯合劑基團締合， 提供放射性標記糖蛋白。
[0021] 在某些實施例中，所述標記分子進一步包括熒光團。在某些實施例中，糖蛋白包括 抗體或？(：融合蛋白。在某些實施例中，抗體是1 §4、1§￡、1§0、1§6、1§11或1 §￥。在某些實施 例中，抗體具有細胞相關抗原親和力。
[0022] 在某些實施例中，在步驟（C)之前，所述方法進一步包括以下步驟：提供包含帶 GlcNAc-GlcNAc鍵的低聚糖的糖蛋白；提供酶，以在GlcNAc-GlcNAc鍵處裂解低聚糖；使所 述糖蛋白與酶接觸，提供含末端GlcNAc殘基的糖蛋白。在某些實施例中，所述酶是糖類內 切酶。
[0023] 在某些實施例中，在步驟（C)之前，所述方法進一步包括以下步驟：提供包含帶 NeuAc-Gal-GlcNAc鍵的低聚糖的糖蛋白；提供酶，以在NeuAc-Gal-GlcNAc鍵處裂解低聚 糖；使所述糖蛋白與酶接觸，提供包含帶Gal-GlcNAc鍵的低聚糖的糖蛋白。在某些實施例 中，所述酶是唾液酸酶。在某些實施例中，所述包含帶Gal-GlcNAc鍵的低聚糖的糖蛋白進 一步與第二種酶接觸，以在Gal-GlcNAc鍵處裂解所述低聚糖，得到包含帶末端GIcNAc殘基 的低聚糖的糖蛋白。在某些實施例中，所述第二種酶是(6-半乳糖苷酶。
[0024] 在某些實施例中，在步驟（c)之前，所述方法進一步包括以下步驟：提供包含帶 Gal-GlcNAc鍵的低聚糖的糖蛋白；提供酶，以在Gal-GlcNAc鍵處裂解低聚糖；使所述糖蛋 白與酶接觸，提供包含帶末端GIcNAc殘基的低聚糖的糖蛋白。在某些實施例中，所述酶是 3 -半乳糖苷酶。
[0025] 在某些實施例中，所述的經過修飾的糖通過半乳糖轉移酶連接到末端GIcNAc殘 基上。在某些實施例中，所述半乳糖轉移酶是突變的半乳糖轉移酶。在某些實施例中，所述 半乳糖轉移酶是Y289L突變的半乳糖轉移酶。
[0026] 在某些實施例中，提供了標記糖蛋白的方法，所述方法包括：
[0027] a)提供一種包含末端GlcNAc殘基的糖蛋白；
[0028] b)提供一種包含化學手柄的經過修飾的糖；
[0029] c)使糖蛋白與經過修飾的糖接觸，其中所述的經過修飾的糖與末端GlcNAc殘基 連接，提供修飾糖蛋白；
[0030] d)提供包括金屬離了螯合劑基團、反應性基團和熒光團的標記分子；
[0031] e)使修飾糖蛋白與標記分子接觸，其中所述反應性基團與化學手柄連接，提供標 記糖蛋白；
[0032] f)提供放射性金屬離子；及
[0033] g)使標記糖蛋白與放射性金屬離子接觸，其中所述金屬離子與螯合劑基團締合， 提供放射性標記糖蛋白。
[0034] 在某些實施例中，所述糖蛋白包括抗體或Fc融合蛋白。在某些實施例中，抗體是 IgA、IgE、IgD、IgG、IgM或IgY。在某些實施例中，抗體具有細胞相關抗原親和力。
[0035] 在某些實施例中，在步驟（c)之前，所述方法進一步包括以下步驟：提供包含帶 GlcNAc-GlcNAc鍵的低聚糖的糖蛋白；提供酶，以在GlcNAc-GlcNAc鍵處裂解低聚糖；使所 述糖蛋白與酶接觸，提供含末端GlcNAc殘基的糖蛋白。在某些實施例中，所述酶是糖類內 切酶。
[0036] 在某些實施例中，在步驟（C)之前，所述方法進一步包括以下步驟：提供包含帶 NeuAc-Gal-GlcNAc鍵的低聚糖的糖蛋白；提供酶，以在NeuAc-Gal-GlcNAc鍵處裂解低聚 糖；使所述糖蛋白與酶接觸，提供包含帶Gal-GlcNAc鍵的低聚糖的糖蛋白。在某些實施例 中，所述酶是唾液酸酶。在某些實施例中，所述包含帶Gal-GlcNAc鍵的低聚糖的糖蛋白進 一步與第二種酶接觸，以在