驅散轉移的能量。當烙解探針是完整的且不與其祀雜交時，在兩個巧光部分 之間通常發生能量轉移，使得來自供體巧光部分的巧光發射被巧滅。當烙解探針與其祀核 酸序列雜交時，巧光部分和對應的巧滅劑變得在空間上(speciallly)分開，而烙解探針變 得巧光更強。通常使用的供體-受體對包括FAM-TAMRA對。通常使用的巧滅劑是DABCTL和 TAMRA。通常使用的黑暗巧滅劑包括黑桐巧滅劑（BlackHole Quenchers? ) (BHQ) (Biosearch Technologies, Inc., Novato , Cal.)、Iowa Black? (Integrated DNA Tech., Inc., Coralville, Iowa)'BlackBeriT ? 巧滅劑650 (BBQ-650) (BeriT & Assoc., Dexter, Mich.)。
[004引巧光分析可使用，例如，光子計數落射巧光(epi化oroscent)顯微鏡系統（其含有 用于在特定范圍監測巧光發射的適宜的二向色鏡(dichroic mirror)和濾光器），光子計數 光電倍增器系統，或巧光計進行。啟動能量轉移的激發可用氣離子激光、高強度水銀化g)弧 光燈、纖維光學光源，或用于在所需的范圍內激發的適當過濾的其它高強度光源進行。 [0049]如本文所用的關于供體和對應的受體巧光部分，"對應的"指具有重疊供體巧光部 分的激發光譜的發射光譜的受體巧光部分。受體巧光部分的發射光譜的最大波長應該比供 體巧光部分的發射光譜的最大波長大至少100 nm。因此，有效的非-放射性能量轉移可在其 間產生。
[0050] 通常選擇巧光供體和對應的受體部分用于：（a)高效率Forster能量轉移；（b)大的 最終Stokes偏移（〉100 nm);(c)盡可能進入紅色可見光譜部分（〉600 nm)的發射偏移；和 (d)向比由在供體激發波長激發所產生的拉曼水巧光發射更高的波長的發射偏移。例如，可 選擇具有其在激光譜線附近的激發最大值(例如，氮-儒442 nm或氣488 nm)、高消光系數、 高量子產率，及其巧光發射與對應的受體巧光部分的激發光譜良好重疊的供體巧光部分。 可選擇具有高消光系數、高量子產率、其激發與供體巧光部分的發射良好重疊，和在紅色可 見光譜部分(>600 nm)發射的對應的受體巧光部分。
[0051] 可在FRET技術中與各種受體巧光部分一起使用的代表性供體巧光部分包括巧光 素、巧光黃(Lucifer化IlowKB-藻紅蛋白、9-日丫晚異硫氯酸鹽、巧光黃VS、4-乙酷氨基-4'-異硫代-氯酷巧-2，2二橫酸、7-二乙基氨基-3-(4異硫代氯酷苯基)-4-甲基香豆素、班 巧酷亞胺1-巧下酸醋，和4-乙酷氨基-4異硫代氯酷巧-2，2二橫酸衍生物。代表性的受 體巧光部分，取決于所用的供體巧光部分，包括LC Red 640、LC Red 705、切5、切5.5、麗絲 胺羅丹明B橫酷氯(Xissamine rhodamine B sulfon}d chloride)、四甲基羅丹明異硫代氯 酸鹽、羅丹明X異硫代氯酸鹽、赤薛紅異硫氯酸醋（^ryt虹OSine iSOtMocyanate)、巧光素、 二乙撐=胺五乙酸醋，或銅系離子(例如，館，或鋪）的其它馨合物。可獲得供體和受體巧光 部分，例如從Molecular Probes (Junction City, Oreg.)或Sigma Qiemical Co. (St. Louis, Mo.)。
[0052] 供體和受體巧光部分可通過連接臂與適宜的探針寡核巧酸連接。每個連接臂的長 度是重要的，因為連接臂將影響供體和受體巧光部分之間的距離。用于本發明目的的連接 臂的長度是W埃(A)計的從核巧酸堿基至巧光部分的距離。一般來說，連接臂是從約10 A至 約25 A。連接臂可具有在WO 84/03285中描述的種類。WO 84/03285也公開了用于將連接臂 與特定的核巧酸堿基連接，并且也用于將巧光部分與連接臂連接的方法。
[0053] 受體巧光部分例如LC Red 640-NHS-醋可與C6-亞憐酷胺（Phosphoramidites) (可從 ABI (Foster City, 或 Glen Research (Sterling,化.）獲得）組合，W 產生 例如LC Red 640-亞憐酷胺。將供體巧光部分例如巧光素與寡核巧酸連接的常用的接頭 (linker)包括硫脈接頭（Fnc-衍生的，例如，購自Glen Research或化emGene (Ashland, Mass .)的巧光素 -CPG ' S)、酷胺-接頭（巧光素-NHS-醋-衍生的，例如購自BioGenex (San Ramon，Calif.)的巧光素-CPG)，或在寡核巧酸合成后巧光素-NHS-醋連接所需要的3 氨 基-CPGS。
[0054] 在樣品中檢測祀核酸中的SNP 本公開內容提供用于在生物學或非-生物學樣品中檢測祀核酸中存在或不存在SNP的 方法。由本發明提供的方法避免了樣品污染、假陰性，和假陽性的問題。所述方法包括進行 至少一個循環步驟(該步驟包括使用一個或一對引物，從樣品擴增祀核酸分子的一部分）、 雜交步驟(包括使擴增產物與烙解探針接觸），和檢測步驟。優選在一個熱循環儀中進行多 個循環步驟。所公開的方法可使用野生型或SNP特異性探針(根據選擇的設計)進行，W在樣 品中檢測祀核酸中存在或不存在SNP。
[0055] 如本文所述的，擴增產物可使用利用FRET技術的標記烙解探針檢測。一種FRET形 式(format)利用用兩個巧光部分標記的一個單鏈烙解探針。當第一巧光部分用合適波長的 光激發時，吸收的能量根據FRET的原理被轉移至第二巧光部分。第二巧光部分通常是巧滅 劑分子。在PCR反應的退火步驟期間，標記的烙解探針與祀DNA (即，擴增產物)結合，結果， 激發的巧光部分和巧滅劑部分變得在空間上彼此分離。結果，在不存在巧滅劑的情況下激 發第一巧光部分時，可檢測到來自第一巧光部分的巧光發射。
[0056] 也可使用與FRET結合的分子信標利用本發明的實時PCR方法來檢測擴增產物的存 在。分子信標技術使用用第一巧光部分和第二巧光部分標記的雜交探針。第二巧光部分通 常為巧滅劑，和巧光標記通常位于探針的每一端。分子信標技術使用具有允許二級結構形 成(例如，發夾）的序列的探針寡核巧酸。由于探針內形成二級結構，當探針在溶液中時，兩 個巧光部分在空間上接近。在與祀核酸（即，擴增產物)雜交后，探針的二級結構被破壞和巧 光部分變得彼此分開，W致在用合適波長的光激發后，可檢測到第一巧光部分的發射。
[0057] 取決于測定法的設計，存在FRET可指示在樣品中存在祀核酸，而不存在FRET可指 示樣品中不存在祀核酸。例如，雜交探針的預定烙解溫度的降低偏移指示樣品中存在SNP， 而其中不存在雜交探針的預定烙解溫度的降低偏移指示樣品中不存在SNP。
[0058] 可使用的代表性生物學樣品包括，但不限于皮膚拭子、鼻拭子、傷口拭子、血培養 物、皮膚，和軟組織感染。生物學樣品的收集和膽存方法是本領域技術人員已知的。生物學 樣品可經處理(例如，通過本領域已知的核酸提取方法和/或試劑盒），W釋放核酸，或者在 一些情況下，生物學樣品可與PCR反應組分和適宜的寡核巧酸直接接觸。
[0059] 烙解曲線分析是可包括在循環分布型（cycling profile)中的步驟。烙解曲線分 析是基于DNA在稱為烙解溫度(Tm)的特征性溫度下烙解的事實，該溫度定義為DNA雙鏈的一 半分開成單鏈時的溫度。DNA的烙解溫度主要取決于其核巧酸組成。因此，富含G和C核巧酸 的DNA分子比具有豐富的A和T核巧酸的那些具有更高的Tm。通過檢測信號失去時的溫度，可 確定探針的烙解溫度。類似地，通過檢測信號產生時的溫度，可確定探針的退火溫度。取決 于測定法的設計，來自擴增產物的烙解探針的實際預定烙解溫度(在使用具有S SNP特異性 序列的烙解探針的情況下），或從預定烙解溫度的降低偏移(在使用具有S野生型序列的烙 解探針的情況下)可證實在樣品的祀核酸序列中存在或不存在SNP。
[0060] 在每個熱循環儀運行中，對照樣品也可W循環。陽性對照樣品可使用，例如對照引 物和對照探針，擴增核酸對照模板(并非所述祀核酸序列的擴增產物）。陽性對照樣品也可 擴增，例如，含有核酸分子的質粒構建體。運樣的質粒對照可W在內部擴增(例如，在所述樣 品內）或在與患者的樣品并行的單獨樣品運行中擴增。每個熱循環儀運行也可包括例如缺 乏祀模板DNA的陰性對照。運樣的對照是擴增、雜交，和/或FRET反應的成功或失敗的指標。 因此，對照反應可容易地確定例如，引物進行序列-特異性退火和啟動延長的能力，W及探 針進行序列-特異性雜交和使FRET發生的能力。
[0061 ]在一個實施方案中，本發明的方法包括避免污染的步驟。例如，利用尿喀晚-DNA糖 基化酶的酶促方法描述于美國專利號5，035，996、5，683，896和5，945，313中，W減輕或消除 一次熱循環儀運行和下次運行之間的污染。
[0062]與FRET技術結合的常規PCR方法可被用來實施所述方法。在一個實施方案中，使用 Light切Cler ?儀器。W下專利應用描述如用于Light切Cler ?技術的實時PCR:W0 97/ 46707、W0 97/46714,和WO 97/46712。
[0063] 應該理解，本發明的實施方案不受一種或多種商業可獲得的儀器配置的限制。
[0064] 制備物品/試劑盒 本發明的實施方案還提供用于制備物品或試劑盒，W在樣品中檢測祀核酸中的SNPnffjU 備物品可包括用來檢測祀核酸中的SNP的引物和烙解探針，W及合適的包裝材料。用于在樣 品中檢測祀核酸中的SNP的代表性引物和烙解探針能夠與祀核酸分子雜交。此外，試劑盒也 可包括用于DNA固定、雜交，和檢測所需的合適包裝的試劑和材料，運樣的固體支持物、緩沖 劑、酶，和DNA標準品。本文中公開了設計引物和烙解探針的方法，并提供擴增祀核酸分子并 與其雜交的引物和烙解探針的代表性實例。
[0065] 本發明的制備物品也可包括一個或多個用于標記烙解探針的巧光部分，或者，備 選地，可將與試劑盒一起供應的烙解探針標記。例如，制備物品可包括用于標記烙解探針的 供體和/或受體巧光部分。W上提供了合適的FRET供體巧光部分和對應的受體巧光部分的 實例。
[0066] 制備物品也可包括包裝插頁或包裝標記，其上有使用引物和烙解探針在樣品中檢 測祀核酸中存在或不存在SNP的使用說明。制備物品可另外包括用于進行本文公開的方法 的試劑(例如，緩沖劑、聚合酶、輔因子，或防止污染的劑）。運樣的試劑可W特定地用于本文 所述的一種商業可獲得的儀器。
[0067] 本公開內容的實施方案將于W下實施例中進一步描述，運些實施例并不限制在權 利要求書中描述的本發明的范圍。 實施例
[0068] 提供W下實施例和附圖W幫助理解本發明，其真正的范圍在所附的權利要求書中 闡明。應該理解，修飾可在不背離本發明的精神的情況下