祀核酸序列的引物和探針。同樣，可由本 領域技術人員使用常規方法評價功能性變體的特異性和/或靈敏性。代表性的功能性變體 可包括，例如，在本文公開的引物和/或探針中的一個或多個缺失、插入，和/或取代。例如， 可提供引物或探針的基本相同的變體，其中所述變體具有與一個原始引物和探針，或其互 補部分的至少，例如80%、90%，或95%的序列同一性。可鑒定任何引物和/或探針的功能活性 變體，其在本文所述的方法或試劑盒中提供與各自原始序列相比類似或更高的特異性和靈 敏性。
[0034] 如上文所詳述，引物（和/或探針）可經化學修飾，即引物和/或探針可包含修飾的 核巧酸或非-核巧酸化合物。那么探針（或引物）為修飾的寡核巧酸。"修飾的核巧酸"（或 "核巧酸類似物"）經一些修飾而不同于天然"核巧酸"，但仍由堿基或堿基樣化合物、巧喃戊 糖或巧喃戊糖-樣化合物、憐酸部分或憐酸-樣部分，或其組合組成。例如，"標記"可與"核巧 酸"的堿基部分連接，由此獲得"修飾的核巧酸"。在"核巧酸"中的天然堿基也可由例如，7-脫氮嚷嶺(deazapurine)替代，同樣由此獲得"修飾的核巧酸"。術語"修飾的核巧酸"或"核 巧酸類似物"在本申請可互換使用。"修飾的核巧"（或"核巧類似物"）通過W上對"修飾的核 巧酸"（或"核巧酸類似物"）概述的方式的一些修飾而不同于天然核巧。
[0035] 寡核巧酸(包括擴增祀核酸序列的修飾的寡核巧酸和寡核巧酸類似物)可使用，例 如，計算機程序例如OLIGO (Molecular Biology Insi曲ts Inc., Cascade, Colo.)設計。 當設計要用作擴增引物的寡核巧酸時，重要的特征包括，但不限于，促進檢測(例如，通過電 泳)的適宜大小的擴增產物，用于一對引物成員的類似的烙解溫度，和每個引物的長度（即， 需要引物的長度足W序列-特異性退火和啟動合成，但不可長到導致在寡核巧酸合成期間 使得保真性降低）。通常，寡核巧酸引物的長度為8-50個核巧酸(例如，長度為8、10、12、14、 16、18、20、22、24、26、28、30、32、：34、36、38、40、42、44、46、48，或50個核巧酸）。在一些實施方 案中，引物具有40個或更少的核巧酸和/或長度在8和40個核巧酸之間。在其它實施方案中， 引物具有30個或更少的核巧酸和/或長度在8和30個核巧酸之間。在其它實施方案中，引物 具有25個或更少的核巧酸和/或長度在8和25個核巧酸之間。在某些實施方案中，寡核巧酸 引物的長度在12和40個核巧酸之間（如12和30之間，12和25之間）。
[0036] 除了一組引物外，本發明方法可使用一個或多個探針，W檢測在祀核酸序列中存 在或不存在SNP。術語"探針"指經合成方法或生物方法產生的核酸化NA或RNA)，其通過設計 或選擇，含有允許它們在規定的預定嚴格性(stringencies)下，特異性地（即，優先地)與 "祀核酸"雜交的特定核巧酸序列。"探針"可稱為"檢測探針"，意指它檢測祀核酸。在本發明 的一些實施方案，所述探針可用至少一個巧光標記物標記。在一個實施方案中，探針可用供 體巧光部分，例如巧光染料，和對應的受體巧光部分，例如巧滅劑標記。
[0037] 設計要用作雜交探針的寡核巧酸可W類似于設計引物的方式進行。本發明的實施 方案可使用單一探針或探針對用于檢測擴增產物。取決于實施方案，探針使用可包含至少 一個標記和/或至少一個巧滅劑部分。像引物一樣，探針通常具有類似的烙解溫度，且每個 探針的長度對于序列-特異性雜交發生必須是足夠的，但不可長到導致在合成期間使得保 真性降低。通常，寡核巧酸探針的長度為8-50個核巧酸(例如，長度為8、10、12、14、16、18、 20、22、24、26、28、30、32、：34、36、38、40、42、44、46、48，或50個核巧酸）。在一些實施方案中， 探針具有40個或更少的核巧酸和/或長度在8和40個核巧酸之間。在其它實施方案中，探針 具有30個或更少的核巧酸和/或長度在8和30個核巧酸之間。在其它實施方案中，探針具有 25個或更少的核巧酸和/或長度在8和25個核巧酸之間。在某些實施方案中，寡核巧酸探針 在12和40個之間。在其它實施方案中，探針具有30個或更少的核巧酸和/或長度在12和30個 核巧酸之間。在其它實施方案中，探針具有25個或更少的核巧酸和/或長度在12和25個核巧 酸之間。在一些實施方案中，寡核巧酸探針的長度在15和40個之間（如在15和30之間，15和 25之間）的核巧酸(例如，16、18、20、21、22、23、24，或25個核巧酸）。
[0038] 構建體可包括各含有一個引物或探針核酸分子的載體。構建體可被例如用作對照 模板核酸分子（conhol template nucleic acid molecules)。適用于本發明的載體經市 售獲得和/或通過本領域的常規重組核酸技術方法產生。適用于所述方法的構建體通常，除 了引物和探針核酸分子之外，還包括編碼用于選擇所需構建體和/或轉化子的可選擇的標 記物(例如，抗生素抗性基因），和復制起點的序列。載體系統的選擇通常取決于幾個因素， 包括但不限于，宿主細胞的選擇、復制效率、選擇性、可誘導性，和回收的容易性。
[0039] 含有引物和探針核酸分子的構建體可在宿主細胞中增殖。如本文所用的，術語宿 主細胞意欲包括原核生物和真核生物，例如酵母、植物和動物細胞。原核生物宿主可包括大 腸桿菌化.coli)、鼠傷寒沙口氏菌（Salmonella typhimurium)、粘質沙雷氏菌（Serratia marcescens)，和枯草芽胞桿菌(Bacil Ius subtil is)。真核生物宿主包括酵母例如釀酒酵 母(S. cerevisiae)、稷酒裂殖酵母(S. pombe)、畢赤酵母(Pichia pastoris)，哺乳動物細 胞例如COS細胞或中國倉鼠卵巢（CHO)細胞、昆蟲細胞，和植物細胞例如擬南芥 (Arabidopsis thaliana)和煙草(Nicotiana tabacum)。構建體可使用本領域普通技術人 員通常已知的任何技術引入宿主細胞。例如，憐酸巧沉淀、電傳孔，熱休克、脂質轉染法、微 注射，和病毒介導的核酸轉移是將核酸引入宿主細胞的普通方法。此外，裸DNA可直接遞送 至細胞(見例如，美國專利號5，580，859和5，589，466)。
[0040] 聚合酶鏈反應(PCR) 美國專利號 4,683，202、4,683，195、4,800,159,和4,965,188 公開常規 PCR 技術。PCR 通 常使用與選擇的核酸模板(例如，DNA或RNA)結合的兩個寡核巧酸引物。可用于所公開的實 施方案的引物包括能夠用作在祀核酸序列中起始核酸合成的點的寡核巧酸。引物可通過常 規方法從限制消化中純化，或它可經合成方法產生。為了最大的擴增效率，引物優選地為單 鏈的，但引物可W是雙鏈的。雙鏈引物首先被變性，即經處理使鏈分開。使雙鏈核酸變性的 一個方法是通過加熱。
[0041 ]如果模板核酸是雙鏈的，在可將其用作PCR的模板前有必要將兩個鏈分開。鏈分開 可通過任何合適的變性方法完成，所述方法包括物理、化學或酶方法。分離核酸鏈的一個方 法設及加熱核酸，直至它大部分變性(例如，大于50%、60%、70%、80%、90%或95%變性）。使模板 核酸變性所必需的加熱條件將，例如取決于緩沖鹽濃度和要變性的核酸的長度和核巧酸組 成，但通在約90°C-約105°C的范圍內維持一段時間，運取決于反應的特征例如溫度和核酸 長度。變性通常進行約30秒-4分鐘(例如，1分鐘-2分鐘30秒，或1.5分鐘）。
[0042]如果雙鏈模板核酸經加熱變性，則允許反應混合物冷卻至促進每個引物與所述祀 核酸分子(例如，其含有SNP)上的它的祀序列退火的溫度。復性的溫度通常是從約35°C至約 65°C (例如，約40°C至約60°C ;約45°C至約50°C )。復性時間可W是從約10秒至約1分鐘（例 如，約20秒至約50秒；約30秒至約40秒）。然后將反應混合物調節至提高聚合酶的活性或使 其活性最優化的溫度，即足W從退火引物發生延伸，W生成與模板核酸互補的產物的溫度。 所述溫度應足W從每個與核酸模板退火的引物合成延伸產物，但不應高到使得延伸產物從 其互補模板上變性(例如，用于延伸的溫度通常介于約40°C至約80°C的范圍內（例如，約50 °C至約70°C;約60°C)。延伸時間可從約10秒至約5分鐘(例如，約30秒至約4分鐘；約I分鐘至 約3分鐘;約1分鐘30秒至約2分鐘）。
[0043] PCR測定法可采用引物和探針核酸例如RNA或DNA (cDNA)。模板核酸不必純化;它 可W是復雜混合物的次級級分，例如包含在人細胞中的含有SNP的核酸。含有SNP的核酸分 子可通過常規技術例如描述于診斷學分子微生物學：原理和應用(Diagnostic Molecular Microbiology: Principles and Applications) (Persing等人（eds), 1993,美國微生 物學協會(American Society for Microbiology),華盛頓特區）中的那些技術，從生物學 樣品中提取。核酸可從任何數目的來源(如質粒），或天然來源(包括細菌、酵母、病毒、細胞 器，或更高級的生物體例如植物或動物)獲得。
[0044] 寡核巧酸引物在誘導引物延伸的反應條件下，與PC時式劑組合。例如，鏈延伸反應 通常包括 50 mM KCUlO mM IYis-HCl (pH 8.3)、15 mM MgCl2、0.001% (w/v)明膠、0.5-1.0 yg變性模板DNA、50皮摩爾的各寡核巧酸引物、2.5 U的化q聚合酶，和10% DMSO)。反應 通常含有每一種為150-320 yM的(141?、(1口1\(17^、(《^?，或其一種或多種類似物。
[0045] 新合成的鏈形成可用于該反應的后續步驟的雙鏈分子。鏈分開、退火，和延伸的步 驟可根據需要而多次重復進行，W產生所需量的與祀核酸分子對應的擴增產物。該反應的 限制因素是存在于反應中的引物、熱穩定性酶，和=憐酸核巧的量。循環步驟（即，變性、退 火，和延伸)優選重復至少一次。為用于檢測，循環步驟的數目將，例如，取決于樣品的性質。 如果樣品是核酸的復雜混合物，將需要更多的循環步驟W擴增足W檢測的祀序列。通常地， 循環步驟重復至少約20次，但可重復多達40、60,或甚至100次。
[0046] 巧光共振能量轉移(FRET) FRET 技術(見，例如美國專利號 4,996，143、5,565,322、5,849,489,和6,162,603)是基 于運樣的概念：當供體巧光部分和對應的受體巧光部分被定位在彼此的一定距離內時，在 兩個巧光部分之間發生能量轉移，其可W被可視化或W其它方式檢測到和/或量化。當通過 合適的波長的光福射激發供體時，供體通常將能量轉移至受體。受體通常W不同波長的光 福射形式重新發射轉移的能量。
[0047] 在一個實施例中，寡核巧酸烙解探針可含有供體巧光部分和對應的巧滅劑，其W 并非光的形式