使用重疊引物和熔解探針檢測單核苷酸多態性的制作方法
【專利說明】使用重疊引物和膝解探針檢測單核昔酸多態性 發明領域
[0001] 本發明設及基于聚合酶鏈反應(PCR)的診斷學領域，且更特別地，設及擴增和檢測 具有單核巧酸多態性(SNP)的祀核酸的序列變異的方法。
[0002] 發明背景 通過使用巧光標記的烙解探針的PCR檢測SNPs先前已有描述（見例如，Huang等人， 2011，PLoS 0肥 6(4) el9206和Luo等人，2011，J. Clin. Microbiol., 49(9)3132-3138)。傳統的烙解通過在不存在SNP和存在SNP的情況下，分析具有祀的巧光標記探針的 后-PCR烙解溫度而進行。精屯、設計的烙解探針產生烙解溫度(Tm),其在不存在SNP的情況下 最高，且探針結合區域中發生的任何堿基對改變引起烙解溫度的偏移（降低）。烙解溫度的 偏移可被用來區分野生型(WT)和突變(MT)祀。
[0003] 不幸的是，一些目的SNPs位于非-保守的基因區域，在那里附近的序列異質性導致 探針烙解溫度的不想要的偏移。運使得難W將具有沉默突變的WT序列與相關的目的SNPs區 分開。與微生物藥物抗性有關的SNPs是運樣的一些實例，其中賦予藥物抗性的特異性SNPs 位于含有附近的WT沉默突變的基因區域。在運樣的情況下，在目的SNP附近的探針結合區域 中的任何沉默突變也可產生探針烙解溫度的偏移并產生假陽性結果。因此，需要更精確和 有效的方式W在祀核酸中僅檢測目的SNP。本發明的實施方案可解決現存序列異質性問題 并使得精屯、設計的烙解探針能夠僅檢測目的SNP，而不干擾附近的沉默突變。
[0004] 發明概述 本發明的實施方案設及用于在生物學或非-生物學樣品中快速檢測祀核酸中存在或不 存在SNP的方法和試劑盒，例如，通過在單個檢驗管中的實時聚合酶鏈反應檢測一個或多個 SNPs O
[0005] 在一個實施方案中，提供在樣品中檢測祀核酸中的SNP的方法。用于檢測SNP的方 法包括W下步驟:進行擴增步驟，其包括使樣品與具有第一野生型核酸序列的寡核巧酸引 物接觸，其當任何祀核酸存在于樣品中時產生擴增產物;進行雜交步驟，其包括使擴增產物 與具有預定烙解溫度的第二野生型核酸序列的寡核巧酸烙解探針接觸，其中寡核巧酸烙解 探針的第二野生型核酸序列與寡核巧酸引物的第一野生型核酸序列重疊并在所述SNP所位 于的祀核酸區域上，在一端延伸出來一個或多個核巧酸;和檢測擴增產物中存在或不存在 SNP，其中所述寡核巧酸烙解探針的預定烙解溫度的降低偏移指示SNP存在于樣品中，而其 中不存在所述寡核巧酸烙解探針的預定烙解溫度的降低偏移指示樣品中不存在SNP。
[0006] 在另一個實施方案中，提供用于在樣品中檢測祀核酸中的SNP的備選方法。檢測 SNP的備選方法包括W下步驟:進行擴增步驟，其包括使樣品與具有野生型核酸序列的寡核 巧酸引物接觸，當任何祀核酸存在于樣品中時產生擴增產物;進行雜交步驟，其包括使擴增 產物與具有預定烙解溫度的SNP特異性核酸序列的寡核巧酸烙解探針接觸，其中寡核巧酸 烙解探針的SNP特異性核酸序列與寡核巧酸引物的野生型核酸序列重疊，并在所述SNP所位 于的祀核酸區域上，在一端延伸出來一個或多個核巧酸;和檢測擴增產物中存在或不存在 所述SNP，其中所述寡核巧酸烙解探針的預定烙解溫度的降低偏移指示樣品中不存在SNP， 而其中不存在所述寡核巧酸烙解探針的預定烙解溫度的降低偏移指示樣品中存在SNP。
[0007]在又一個實施方案中，提供用于在樣品中檢測祀核酸中的SNP的寡核巧酸引物和 探針集。引物和探針集可包括在可提供檢測SNP的試劑盒中。試劑盒可包括具有第一野生型 核酸序列的寡核巧酸引物，其當任何祀核酸存在于樣品中時產生擴增產物;和具有預定烙 解溫度的第二野生型核酸序列的寡核巧酸烙解探針，其中寡核巧酸烙解探針的第二野生型 核酸序列與寡核巧酸引物的第一野生型核酸序列重疊，并在所述SNP所位于的祀核酸區域 上，在一端延伸出來一個或多個核巧酸;其中憑借所述寡核巧酸烙解探針的預定烙解溫度 的降低偏移指示SNP存在于樣品中和憑借不存在所述寡核巧酸烙解探針的預定烙解溫度的 降低偏移指示樣品中不存在SNP，檢測擴增產物中存在或不存在所述SNP。在另一個實施方 案中，提供用于在樣品中檢測祀核酸中的SNP的備選的寡核巧酸引物和探針集。備選的寡核 巧酸引物和探針集可包括在可提供檢測SNP的試劑盒中。試劑盒可包括具有野生型核酸序 列的寡核巧酸引物，其當任何祀核酸存在于樣品中時產生擴增產物;和具有預定烙解溫度 的SNP特異性核酸序列的寡核巧酸烙解探針，其中寡核巧酸烙解探針的SNP特異性核酸序列 與寡核巧酸引物的第一野生型核酸序列重疊并在所述SNP所位于的祀核酸區域上，在一端 延伸出來一個或多個核巧酸;其中憑借所述寡核巧酸烙解探針的預定烙解溫度的降低偏移 指示樣品中不存在SNP和其中不存在所述寡核巧酸烙解探針的預定烙解溫度的降低偏移指 示SNP存在于樣品中，檢測擴增產物中存在或不存在所述SNP。試劑盒也可包括S憐酸核巧、 核酸聚合酶，和核酸聚合酶的功能所必需的緩沖劑。試劑盒也可包括使用引物、探針，和發 巧光部分來檢測樣品中存在或不存在SNP的包裝插頁和用法說明書。
[000引在一些實施方案中，方法和試劑盒可包括已用供體和相應的受體(acceptor)巧光 部分標記的探針，或可包括用于標記探針的發巧光(f Iuorophoric)部分。在某些運樣的實 施方案中，寡核巧酸（引物和/或探針)具有40個或更少的核巧酸(例如，30個或更少的核巧 酸，25個或更少的核巧酸，20個或更少的核巧酸等）。在某些實施方案中，寡核巧酸的長度介 于8和40個核巧酸之間（如8和30之間，8和25之間，8和20之間）。在某些實施方案中，寡核巧 酸的長度介于12和40個核巧酸之間（如12和30之間，12和25之間，12和20之間）。在一些實施 方案中，寡核巧酸包含至少一個修飾的核巧酸，例如，改變核酸雜交穩定性(與未修飾的核 巧酸相比）。在一些實施方案中，寡核巧酸包含至少一個保守修飾的變異。在一些實施方案 中，寡核巧酸烙解探針可包括允許二級結構形成的核酸序列。寡核巧酸烙解探針可用在5' 末端的巧光部分，和在3'末端的對應的用W巧滅未結合的烙解探針的巧光的受體部分標 記。寡核巧酸烙解探針的核酸序列可提供能使巧光巧滅的隨機卷曲構象，除非寡核巧酸探 針與它的祀雜交。運樣的二級結構形成通常導致第一(例如，巧光團）和第二(例如，巧滅劑） 巧光部分之間的空間鄰近。例如，非-雜交的寡核巧酸烙解探針可被巧滅或僅為微弱巧光 的，但寡核巧酸烙解探針在與其祀雜交時可變為更強巧光的。在從它的祀變性后，寡核巧酸 烙解探針可W返回到其巧滅或弱巧光狀態。因此，烙解探針-祀復合物的巧光強度W祀-依 賴性方式隨著溫度增加而降低，產生不同的源自烙解峰的針對每個祀的烙解溫度值。在一 些實施方案中，寡核巧酸烙解探針的核酸序列包括多個取決于所述SNP核巧酸變異的預定 烙解溫度，其區分所述SNP核巧酸變異。在一些實施方案中，祀核酸包含含有一個或多個突 變的非保守區域，所述突變位于寡核巧酸引物與祀核酸雜交之處。在一些實施方案中，擴增 步驟在第二寡核巧酸引物的存在下進行。
[0009]除非另外限定，本文所用的所有技術和科學術語具有如本發明所屬鄰域的普通技 術人員通常理解的相同意義。雖然與本文所描述的那些類似或等同的方法和材料可用于實 踐或試驗本發明，下文描述了合適的方法和材料。此外，材料、方法，和實施例僅僅是示例性 的并不意圖為限制性的。在附圖和W下的描述中列出了本發明的一個或多個實施方案的細 節。本發明的其它特征、目的，和優點將從附圖和詳細的說明書，W及從權利要求書中變得 顯而易見。
[0010] 附圖簡述 圖1顯示待在含有SNP的不同FT種群中檢測到的示例性SNP的示意圖，其中所述SNP位于 具有附近的序列異質性的非-保守基因區域。
[0011]圖2顯示檢測SNP的示例性引物和探針設計的示意圖，其中引物序列將在待檢測的 SNP之前的一個堿基對"引導"PCR開始，并且重疊烙解探針具有與所述引物相同的序列，并 多延伸一個堿基對，所述堿基對覆蓋該SNP位置。
[001^ 圖3顯示利用用于檢測SNP的重疊引物和探針設計的示例性PCR反應的示意圖。 [001引圖4顯示利用用于檢測SNP的重疊引物和探針設計的PCR反應產物的示例性烙解曲 線分析的示意圖。
[0014] 圖5顯示傳統的烙解曲線分析。
[0015] 圖6顯示在其中探針包括野生型序列的實施方案中利用重疊引物和探針設計的烙 解曲線分析。
[0016] 圖7顯示在其中探針包括SNP特異性序列的實施方案中利用重疊引物和探針設計 的烙解曲線分析。
[0017] 發明詳述 通過核酸擴增在樣品中檢測祀核酸中一個或多個SNPs提供一種快速和精確的檢測 SNPs的方法。本文描述了用于在樣品中檢測祀核酸中的SNP的實時測定法，如用于檢測SNPs 的寡核巧酸引物和探針集。用于檢測SNPs的實時PCR與其它方法相比增加的靈敏性，W及實 時PCR的改進的特征(包括樣品容量和擴增產物的實時檢測），使得為臨床實驗室中的常規 診斷和SNP檢測實施運一技術為切實可行的。
[0018]本發明的實施方案允許，例如，在不同的WT種群中檢測一種特定的SNP (圖1)。實 施方案包括利用重疊寡核巧酸引物和探針設計(也稱為堆疊的寡核巧酸引物和探針)檢測 SNP的方法，其中寡核巧酸引物和寡核巧酸烙解探針的序列彼此重疊，用W檢測位于非-保 守基因區域并含有附近的沉默突變的目的SNP。可將引物序列（正向或反向）設計為會在待 檢測的SNP之前一個或多個堿基對'引導' PCR開始，并且可將重疊烙解探針設計為具有與所 述引物相同的序列，但與所述引物相比多延伸一個或多個堿基，W延伸越過和覆蓋祀核酸 的SNP位置(圖2)。可將引物設計為，在不考慮祀核酸上的引物區域的序列多樣性的情況下， 對'引導'PCR反應而言是足夠耐用和穩健的。適宜的引物設計可包括修飾堿基（穩定劑 (S化Mlizer))，其改進引物在存在錯配(序列多樣性)的情況下的結合能力。運種方式，在 不考慮在引物所雜交區域的祀核酸的初始多樣性的情況下，PCR擴增產物將全部具有滲入 生成的擴增子中的相同引物序列（圖3)。可將引物和探針序列設計為使得探針完全與引物 重疊，且探針延伸出來至少一個堿基W覆蓋在祀或擴增子上的待檢測的目的SNP (例如，在 一些實施方案中，探針的3'端延伸超過引物的3'端至少一個堿基，而在其它實施方案中，探 針的5'端延伸超過引物的5'端至少一個堿基）。運種方式，非目的的和可在祀中目的SNP附 近存在的任何其它SNPs將通過引物延伸（擴增子）而沉默且不影響探針的烙解溫度。備選 地，可將引物和探針序列設計成為使得探針序列并非完全與引物序列重疊，只要被探針所 重疊的引物序列部分覆蓋非目的的和在待檢測的目的SNP附近存在的任何SNP。例如，探針 序列和引物序列之間的最少重疊可W是至少70%-至少90%，在某些實施方案中為至少80%或 至少85%或至少90%。用重