Genes X，Jones&Bartlett 化Wishing出版，2009(ISBN-10:0763766321); W及KerKlrew等 (著），Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference，VCH Publishers，Inc.出版，1995( ISBN 1-56081-569-8)。
[0106] 除非另有說明，使用例如如下著作中所述的標準程序來實施本發明：Sambrook等， Molecular CloningiA Laboratory Manual(第；片反），Cold Spring Harbor Laboratory Press'Cold Spring Ha;rbo;r，N.Y.，USA(2001);Davis等，Basic Methods in Molecular Biology,Elsevier Science Publishing,Inc.,New York，USA(1995);或Methods in Enzymology：Guide to Molecular Cloning Techniques第152卷，S.L. Berger和 A.R.Kimmel 著，Academic Press Inc.，San Diego, USA(1987); W 引用的方式將它們全部整 體并入本文。
[0107] 其它術語在本發明各個方面的描述中進行定義。
[0108] 出于描述和公開的目的，在此W引用的方式將本申請通篇所引用的所有專利與其 它出版物(包括參考文獻、授權專利、公開的專利申請W及共同的未決ko-pending)專利申 請）明確地并入本文，例如在此類出版物中描述的可用于本文所述技術的方法學。運些出版 物僅僅由于它們的公開早于本申請的申請日而提供。在運一方面不應當視作承認本發明人 沒有權利借助于先前的發明或因為任何其它原因而將公開的內容提前。所有關于運些文件 的日期的聲明或運些文件的內容的表述是基于申請人可得的信息，并不構成關于運些文件 的日期或運些文件的內容的正確性的任何承認。
[0109] 對本公開的實施方式的描述不意味著窮舉或將本公開限制在所公開的確切形式。 盡管本文出于說明目的對本公開的【具體實施方式】和實施例進行了描述，本領域技術人員將 會認識到，可在本公開范圍內作出多種等同修改。例如，雖然將方法步驟或功能W給定順序 給出，其它實施方式可W不同順序來實施功能、或可W基本上同時實施運些功能。本文所提 供的本公開的教導可W適當的方式應用于其它程序或方法。可將本文所述的各種實施方式 組合W提供進一步的實施方式。如有需要的話，可對本公開的方面進行修改，W利用上述參 考文獻和申請中的組合物、功能和構思，來提供本公開更進一步的實施方式。可根據詳細描 述來對本公開進行上述改變和其它改變。所有此類修改都旨在落入所附權利要求書的范圍 之內。
[0110] 任何前述實施方式中的具體要素均可進行組合或替代其它實施方式中的要素。此 夕h盡管與本公開的特定實施方式相關的優勢已經在運些實施方式的上下文中描述，其它 實施方式也可表現出此類優勢，但不是所有實施方式都必須展現出此類優勢，才能落入本 公開的范圍。
[0111] 本文所述的技術進一步由W下實施例予W說明，但決不應當理解為本文所述的技 術被進一步限定。
[0112] 可根據任何W下編號段落對本文所述技術的一些實施方式進行定義：
[0113] 1. -種用于對NRAS和/或BRAF的突變進行檢測的測定法，所述測定法包括：
[0114] 將核酸樣本的部分與引物組相接觸，
[0115] 其中，所述引物組包含引物對亞組，其中，各引物對擴增包含序列變異的NRAS或 BRAF序列；
[0116] 對包含所述樣本的所述部分和一個或多個所述引物組的反應混合物實施PCR擴增 方案，所述擴增方案包括鏈分離、引物退火和引物延伸的循環；
[0117] 檢測各引物對的擴增子存在或不存在；
[0118] 其中，擴增子的存在表明存在該引物對對其具有特異性的序列變異；W及
[0119] 其中，所述引物中的一個或多個選自于由SEQ ID NOa-SEQ IDN0:39所組成的組。
[0120] 2.如段落1所述的測定法，其中，所述引物對選自于由如下引物對所組成的組：
[0121] 沈Q ID NO: 1 和沈Q ID NO:8;沈Q ID NO:2和沈Q ID NO:8;SEQ ID NO:3和沈Q ID NO:8;SEQ ID N0:4和SEQ ID NO:8;SEQ ID NO:5和SEQ ID N0:8;SEQ ID N0:6和SEQ ID NO:8;SEQ ID NO:7和沈Q ID NO:8;SEQ ID NO:9和沈Q ID NO: 14;SEQ ID NO: 10和沈Q ID N0:14;沈Q ID N0:11 和沈Q ID N0:14;沈Q ID N0:12和沈Q ID N0:14;沈Q ID N0:13和沈Q ID N0:14;沈Q ID N0:15和沈Q ID N0:18;SEQ ID N0:16和沈Q ID N0:18;沈Q ID N0:17和 沈Q ID NO: 18;沈Q ID NO: 19和沈Q ID NO:33;沈Q ID NO:20和沈Q ID NO:33;沈Q ID NO: 21 和沈Q ID N0:33;沈Q ID N0:22和沈Q ID N0:33;沈Q ID N0:23和沈Q ID N0:33;沈Q ID NO:24和沈Q ID NO:33;沈Q ID NO:25和沈Q ID NO:33;沈Q ID NO :26和沈Q ID NO :32;沈Q ID NO :27和沈Q ID NO :32;沈Q ID NO :28和沈Q ID NO:32;沈Q ID NO:29和沈Q ID NO:32; SEQ ID N0:30和SEQ ID N0:32;SEQ ID N0:31 和沈Q ID N0:32;SEQ ID N0:34和SEQ ID NO:37;沈Q ID NO:35和沈Q ID NO:38; W及沈Q ID NO:36和沈Q ID NO:39。
[0122] 3.如段落I或2所述的測定法，其中，一個或多個所述序列變異為點突變。
[0123] 4.如段落1-3中任一項所述的測定法，其中，NRAS點突變選自于由如下點突變所組 成的組：
[0124] 6120、6125、6134、613(：、6130、6121?、613￥、961化、96化、96化、9611?1^及961尺2。
[0125] 5.如段落1-4中任一項所述的測定法，其中，BRAF點突變選自于由如下點突變所組 成的組：
[01%] V600D TG/AT、V600E T/A、V600E TG/AAW及V600K GT/AA。
[0127] 6.如段落1-5中任一項所述的測定法，其中，對存在或不存在G12D、G12S、G13A、 013(：、6130、6121?、613￥、961化、96化、96化、9611?1^及9611?2進行檢測。
[0128] 7.如段落1-6中任一項所述的測定法，其中，對存在或不存在V600D TG/AT、V600E T/A、V600E TG/AAW及V600K GT/AA進行檢測。
[0129] 8.如段落1-7中任一項所述的測定法，其中，所述核酸樣本由FFPE腫瘤樣本制備。
[0130] 9.如段落1-8中任一項所述的測定法，其中，所述樣本包含來自受試者的腫瘤細 胞，所述受試者診斷患有選自于由如下病癥所組成的組中的病癥：
[0131] 胃癌、腎癌、膽管瘤、肺癌、腦癌、宮頸癌、結腸癌、頭頸部癌、肝細胞瘤、非小細胞肺 癌、黑色素瘤、間皮瘤、多發性骨髓瘤、卵巢癌、肉瘤和甲狀腺癌。
[0132] 10.如段落1-9中任一項所述的測定法，其中，一種或多種所述引物為雙結構域引 物。
[0133] 11.如段落1-10中任一項所述的測定法，其中，來自所述引物組的兩種W上引物對 的擴增產物為可區分的。
[0134] 12.如段落1-11中任一項所述的測定法，其中，借助有區別的大小，將來自所述引 物組的兩種W上引物對的擴增產物區分開。
[0135] 13.如段落1-12中任一項所述的測定法，其中，通過用不同的可檢測標記物進行標 記，將來自所述引物組的兩種W上引物對的擴增產物區分開。
[0136] 14.如段落1-13中任一項所述的測定法，其中，所述引物W約為實施例1的濃度存 在于所述反應混合物中。
[0137] 15.包含一個或多個引物對的組合物，所述引物對選自于由具有如下序列的分子 所組成的組：
[0138] 沈 Q ID NO a和沈 Q ID NO: 8;沈Q ID NO: 2 和沈 Q ID NO: 8; SEQ ID NO: 3 和沈 Q ID NO:8;SEQ ID N0:4和SEQ ID NO:8;SEQ ID NO:5和SEQ ID N0:8;SEQ ID N0:6和SEQ ID NO:8;SEQ ID NO:7和沈Q ID NO:8;SEQ ID NO:9和沈Q ID NO: 14;SEQ ID NO: 10和沈Q ID N0:14;沈Q ID N0:11 和沈Q ID N0:14;沈Q ID N0:12和沈Q ID N0:14;沈Q ID N0:13和沈Q ID N0:14;沈Q ID N0:15和沈Q ID N0:18;SEQ ID N0:16和沈Q ID N0:18;沈Q ID N0:17和 沈Q ID NO: 18;沈Q ID NO: 19和沈Q ID NO:33;沈Q ID NO:20和沈Q ID NO:33;沈Q ID NO: 21 和沈Q ID N0:33;沈Q ID N0:22和沈Q ID N0:33;沈Q ID N0:23和沈Q ID N0:33;沈Q ID NO:24和沈Q ID NO:33;沈Q ID NO:25和沈Q ID NO:33;沈Q ID NO :26和沈Q ID NO :32;沈Q ID NO :27和沈Q ID NO :32;沈Q ID NO :28和沈Q ID NO:32;沈Q ID NO:29和沈Q ID NO:32; SEQ ID N0:30和SEQ ID N0:32;SEQ ID N0:31 和沈Q ID N0:32;SEQ ID N0:34和SEQ ID NO:37;沈Q ID NO:35和沈Q ID NO:38; W及沈Q ID NO:36和沈Q ID NO:39。
[0139] 16.如段落15所述的組合物，所述組合物包含由具有如下序列的分子所組成的引 物對：
[0140] 沈Q ID NO: 1 和沈Q ID NO:8;沈Q ID NO:2和沈Q ID NO:8;SEQ ID NO:3和沈Q ID NO:8;SEQ ID N0:4和SEQ ID NO:8;SEQ ID NO:5和SEQ ID N0:8;SEQ ID N0:6和SEQ ID NO:8;SEQ ID NO:7和沈Q ID NO:8;SEQ ID NO:9和沈Q ID NO: 14;SEQ ID NO: 10和沈Q ID N0:14;沈Q ID N0:11 和沈Q ID N0:14;沈Q ID N0:12和沈Q ID N0:14;沈Q ID N0:13和沈Q ID NO: 14;沈Q ID NO: 15和沈Q ID NO: 18;沈Q ID NO: 16和沈Q ID NO: 18; W及沈Q ID NO: 17和沈Q ID NO: 18。
[0141] 17.如段落15所述的組合物，所述組合物包含由具有如下序列的分子所組成的引 物對：
[0142] 869 10側：19和沈9 10腸：33;沈9 10腸：20和569 10腸：33;沈9 10側：2巧口 沈Q ID NO:33;沈Q ID NO:22和沈Q ID NO:33;沈Q ID NO:23和沈Q ID NO:33;沈Q ID NO: 24和沈Q ID NO:33;沈Q ID NO:25和沈Q ID NO:33;沈Q ID NO:26和沈Q ID NO:32;沈Q ID NO:27和沈Q ID NO:32;沈Q ID NO:28和沈Q ID NO:32;沈Q ID NO:29和沈Q ID NO:32;沈Q ID N0:30和沈Q ID N0:32;沈Q ID N0:31 和沈Q ID N0:32;沈Q ID N0:34和沈Q ID N0:37; 沈Q ID NO:35和沈Q ID NO:38; W及沈Q ID NO:36和沈Q ID NO:39。
[0143] 18.如段落15-17中任一項所述的組合物，其中，所述引物對特異性地雜交至祀多 核巧酸。
[0144] 19.如段落15-18中任一項所述的組合物，其中，各引物對的至少一個成員為巧光 標記的。
[0145] 20.包含巧光標記的擴增產物的組合物，所述巧光標記的擴增產物由利用一個或 多個引物對對祀多核巧酸進行擴增而獲得，所述一個或多個引物對選自于由具有如下序列 的分子所組成的組：
[0146] 沈Q ID NO: 1 和沈Q ID NO:8;沈Q ID NO:2和沈Q ID NO:8;SEQ ID NO:3和沈Q ID NO:8;SEQ ID N0:4和SEQ ID NO:8;SEQ ID NO:5和SEQ ID N0:8;SEQ ID N0:6和SEQ ID NO:8;SEQ ID NO:7和沈Q ID NO:8;SEQ ID NO:9和沈Q ID NO: 14;SEQ ID NO: 10和沈Q ID N0:14;沈Q ID N0:11 和沈Q ID N0:14;沈Q ID N0:12和沈Q ID N0:14;沈Q ID N0:13和沈Q ID N0:14;沈Q ID N0:15和沈Q ID N0:18;SEQ ID N0:16和沈Q ID N0:18;沈Q ID N0:17和 沈Q ID NO: 18;沈Q ID NO: 19和沈Q ID NO:33;沈Q ID NO:20和沈Q ID NO:33;沈Q ID NO: 21 和沈Q ID N0:33;沈Q ID N0:22和沈Q ID N0:33;沈Q ID N0:23和沈Q ID N0:33;沈Q ID NO:24和沈Q ID NO:33;沈Q ID NO:25和沈Q ID NO:33;沈Q ID NO:26和沈Q ID NO:32;沈Q ID NO:27和沈Q ID NO:32;沈Q ID NO:28和沈Q ID NO:32;沈Q ID NO:29和沈Q ID NO:32; SEQ ID N0:30和SEQ ID N0:32;SEQ ID N0:31 和沈Q ID N0:32;SEQ ID N0:34和SEQ ID NO:37;沈Q ID NO:35和沈Q ID NO:38; W及沈Q ID NO:36和沈Q ID NO:39。
[0147] 21.如段落15-20中任一項所述的組合物，所述組合物進一步包含選自于由如下組 分所組成的組中的反應混合物組分：
[0148] 緩沖液、dNTP W及DNA聚合酶。
[0149] 22.如段落15-21中任一項所述的組合物，所述組合物進一步包含由FF陽腫瘤樣本 制備的核酸樣本。
[0150] 23.如段落15-22中任一項所述的組合物，所述組合物進一步包含來自受試者的腫 瘤細胞，所述受試者診斷患有選自于由如下病癥所組成的組中的病癥：
[0151] 胃癌、腎癌、膽管瘤、肺癌、腦癌、宮頸癌、結腸癌、頭頸部癌、肝細胞瘤、非小細胞肺 癌、黑色素瘤、間皮瘤、多發性骨髓瘤、卵巢癌、肉瘤和甲狀腺癌。
[0152] 24.如段落15-23中任一項所述的組合物，其中，所述引物W約為實施例1的濃度存 在。
[0153] 實施例
[0154] 實施例1
[0155] 本文描述了對NRAS/BRAF點突變分析組（point mu1:ation analysis panel)的開 發，該分析組為能夠例如在ICEPlex?系統或類似系統上在單個反應中使用核酸樣本對12種 臨床最重要的NRAS突變W及其它4種BRAF突變進行檢測的多重PCR測定法。
[0156] RAS基因為在人類癌癥中頻繁突變的原癌基因，由S種遍在表達的基因 HRAS、KRAS 和NRAS編碼。運些RAS基因具有GTP/GDP結合活性和GlTase活性，它們的蛋白可參與對細胞 生長的控制。RAS蛋白表現出異構體(isoform)特異性功能;并且在NRAS中，改變第12、13或 61位氨基酸殘基的基因突變活化了所編碼的蛋白使培養的細胞轉化的潛能，其與多種人類 腫瘤(特別是皮膚、血液和淋己組織的癌癥)相關。
[0157] 設計NRAS/BRAF點突變分析組檢測引物，隨后經由計算機模擬（in Si 1 iCO)對引 物-引物相互作用進行分析。使用化ermoBlast?程序、野生型細胞系曲NA和合成的DNA模板 確定交叉反應性。在ICEPlex?系統上對反應條件進行優化。
[015引該單反