用于對nras和braf核酸進行多重分析的組合物及方法
【專利說明】
[0001] 相關申請的交叉引用
[0002] 根據35U.S.C.§119(6)，本申請要求2013年8月14日提交的美國臨時申請號61/ 865，754的優先權，W引用的方式將其內容整體并入本文。
[0003] 序列表
[0004] 本申請包含序列表，所述序列表已經WAScn格式電子提交，并在此W引用的方式 將其整體并入。所述Ascn副本創建于2014年7月29日，命名為046264-078891-PCT_^.txt， 大小為28,830字節。
技術領域
[0005] 本文所述的技術設及使得能夠對突變(包括點突變)的存在和/或不存在進行檢測 的測定法和方法。
【背景技術】
[0006] 個性化醫療的發展使得鑒別了當被突變和改變時可引起疾病的基因。例如，在與 野生型或健康受試者相比時，在患有給定疾病或具有發展為給定疾病風險的受試者中，編 碼基因的序列可能突變。
[0007] 例如，NRAS和BRAF與癌癥相關，任何給定的癌細胞均可展示出NRAS和BRAF二者或 之一的突變。運些突變與例如疾病的嚴重程度和/或對特定治療選項的應答相關。用于檢測 此類突變的傳統方法提供的多重性(multiplex)能力低于綜合臨床診斷所需的水平。多重 測定法的開發可允許更快更經濟地對患者進行測試和篩查，使得健康護理得到改進。
【發明內容】
[0008] 本文所述的技術設及用于對NRAS和/或BRAF的突變(例如序列的改變)進行檢測的 方法和測定法。發明人開發了測定法并發現了方法，W在單個多重測定法中對NRAS和/或 BRAF的突變的存在或不存在進行可靠測定。
[0009] -方面，本文描述了用于對NRAS和/或BRAF的突變進行檢測的測定法，所述測定法 包括:將核酸樣本的部分與引物組相接觸，其中，所述引物組包含引物對亞組，其中，各引物 對擴增包含序列變異的NRAS或BRAF序列;對包含所述樣本的所述部分和一個或多個所述引 物組的反應混合物實施PCR擴增方案(regimen),所述擴增方案包括鏈分離、引物退火和引 物延伸的循環;檢測各引物對的擴增子存在或不存在，其中，擴增子的存在表明存在該引物 對對其具有特異性的序列變異，W及其中，所述引物中的一個或多個選自于由SEQ ID NO: 1-沈Q ID NO:39所組成的組。
[0010] 在一些實施方式中，所述引物對選自于由如下引物對所組成的組:SEQ ID N0:1和 569 10側：8;569 10^:2和569 10側：8;569 10^:3和沈9 10側：8;569 10^:4和 569 10側：8;569 10^:5和569 10側：8;569 10^:6和沈9 10側：8;569 10^:7和 沈Q ID NO:8;SEQ ID NO:9和沈Q ID NO: 14;沈Q ID NO: 10和沈Q ID NO: 14;沈Q ID NO: 11 和沈9 10側：14;569 10顯：12和沈9 10顯：14;569 10側：13和569 10顯：14;569 10 N0:15和沈Q ID N0:18;沈Q ID N0:16和沈Q ID N0:18;沈Q ID N0:17和沈Q ID N0:18;沈Q ID N0:19和沈Q ID N0:33;沈Q ID N0:20和沈Q ID N0:33;沈Q ID N0:21 和沈Q ID N0:33; SEQ ID NO :22和SEQ ID NO :33; SEQ ID NO :23和沈Q ID NO :33; SEQ ID NO :24和SEQ ID NO:33;沈Q ID NO:25和沈Q ID NO:33;沈Q ID NO:26和沈Q ID NO :32;沈Q ID NO :27和沈Q ID NO :32;沈Q ID NO :28和沈Q ID NO :32;沈Q ID NO:29和沈Q ID NO:32;沈Q ID NO:30和 沈Q ID N0:32;沈Q ID N0:31 和沈Q ID N0:32;沈Q ID N0:34和沈Q ID N0:37;沈Q ID NO: 35和沈Q ID NO:38; W及沈Q ID NO: 36和沈Q ID NO:39。在一些實施方式中，一個或多個序 列變異為點突變。在一些實施方式中，NRAS點突變選自于由如下點突變所組成的組:G12D、 0125、6134、613(：、6130、6121?、613￥、961刖、9611(、96化、9611?1^及9611?2。在一些實施方式 中，BRAF點突變選自于由如下點突變所組成的組:V600D TG/AT、V600E T/A、V600E TG/AAW 及V600K GT/AA。在一些實施方式中，對存在或不存在G12D、G12S、G13A、G13C、G13D、G12R、 613￥、961刖、96化、96化、961則^及9611?2進行檢測。在一些實施方式中，對存在或不存在 V600D TG/AT、V600E T/A、V600E TG/AAW及V600K GT/AA進行檢測。
[0011] 在一些實施方式中，所述核酸樣本由FFPE腫瘤樣本制備。在一些實施方式中，所述 樣本包含來自受試者的腫瘤細胞，所述受試者診斷患有選自于由如下病癥所組成的組中的 病癥：胃癌、腎癌、膽管瘤、肺癌、腦癌、宮頸癌、結腸癌、頭頸部癌、肝細胞瘤、非小細胞肺癌、 黑色素瘤、間皮瘤、多發性骨髓瘤、卵巢癌、肉瘤和甲狀腺癌。
[0012] 在一些實施方式中，一種或多種引物為雙結構域引物。在一些實施方式中，來自引 物組的兩種W上引物對的擴增產物為可區分的。在一些實施方式中，借助有區別的大小 (distinct sizes)，將來自引物組的兩種W上引物對的擴增產物區分開。在一些實施方式 中，通過用不同的可檢測標記物進行標記，將來自引物組的兩種W上引物對的擴增產物區 分開。在一些實施方式中，所述引物W約為實施例1的濃度存在于反應混合物中。
[0013] -方面，本文描述了包含一個或多個引物對的組合物，所述引物對選自于由具有 如下序列的分子所組成的組：SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:8; SEQ ID NO: 2和沈Q ID N0:8; SEQ ID NO:3和沈Q ID NO:8;SEQ ID NO:4和沈Q ID NO:8;沈Q ID NO:5和SEQ ID NO:8; 沈Q ID NO:6和沈Q ID N0:8;SEQ ID NO:7和沈Q ID NO:8;SEQ ID NO:9和沈Q ID NO: 14; SEQ ID N0:10和SEQ ID N0:14;SEQ ID N0:11 和沈Q ID N0:14;SEQ ID N0:12和SEQ ID N0:14;沈Q ID N0:13和沈Q ID N0:14;沈Q ID N0:15和沈Q ID N0:18;沈Q ID N0:16和沈Q ID N0:18;沈Q ID N0:17和沈Q ID N0:18;SEQ ID N0:19和沈Q ID N0:33;沈Q ID N0:20和 沈Q ID N0:33;沈Q ID N0:21 和沈Q ID N0:33;沈Q ID N0:22和沈Q ID N0:33;沈Q ID NO: 23和沈Q ID NO :33;沈Q ID NO :24和沈Q ID NO:33;沈Q ID NO:25和沈Q ID NO:33;沈Q ID NO:26和沈Q ID NO:32;沈Q ID NO:27和沈Q ID NO:32;沈Q ID NO :28和沈Q ID NO :32;沈Q ID NO :29和沈Q ID NO :32;沈Q ID NO :30和沈Q ID NO:32;沈Q ID NO:31和沈Q ID NO:32; SEQ ID NO:：M和沈Q ID NO:37;SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:38; W及沈Q ID NO:36和SEQ ID N0:39。在一些實施方式中，所述組合物可包含由具有如下序列的分子所組成的引物對： SEQ ID NO: 1 和沈Q ID NO:8;SEQ ID NO:2和沈Q ID NO:8;沈Q ID NO:3和SEQ ID NO:8; SEQ ID NO:4和沈Q ID NO:8;SEQ ID NO:5和沈Q ID NO:8;沈Q ID NO:6和SEQ ID NO:8; SEQ ID NO:7和沈Q ID NO:8;SEQ ID NO:9和沈Q ID NO: 14;SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 14;沈Q ID NO: 11 和沈Q ID NO: 14;沈Q ID NO: 12和沈Q ID NO: 14;沈Q ID NO: 13和沈Q ID NO: 14;沈Q ID NO: 15和沈Q ID NO: 18;SEQ ID NO: 16和沈Q ID NO: 18; W及沈Q ID NO: 17 和SEQ ID NO: 18。在一些實施方式中，所述組合物可包含由具有如下序列的分子所組成的 引物對：SEQ ID N0:19和沈Q ID N0:33;SEQ ID N0:20和SEQ ID N0:33;SEQ ID N0:21 和 沈Q ID NO:33;沈Q ID NO:22和沈Q ID NO:33;沈Q ID NO:23和沈Q ID NO:33;沈Q ID NO: 24和沈Q ID NO :33;沈Q ID NO :25和沈Q ID NO:33;沈Q ID NO:26和沈Q ID NO:32;沈Q ID NO:27和沈Q ID NO:32;沈Q ID NO:28和沈Q ID NO:32;沈Q ID NO :29和沈Q ID NO :32;沈Q ID N0:30和沈Q ID N0:32;沈Q ID N0:31 和沈Q ID N0:32;沈Q ID N0:34和沈Q ID N0:37; 沈Q ID N0:35和SEQ ID N0:38;W及沈Q ID N0:36和沈Q ID N0:39。在一些實施方式中，所 述引物對特異性地雜交至祀多核巧酸。在一些實施方式中，各引物對的至少一個成員為巧 光標記的。
[0014] -方面，本文描述了包含巧光標記的擴增產物的組合物，所述巧光標記的擴增產 物由利用一個或多個引物對對祀多核巧酸進行擴增而獲得，所述一個或多個引物對選自于 由具有如下序列的分子所組成的組：SEQ ID NO: 1和沈Q ID NO:8;沈Q ID NO: 2和沈Q ID NO:8;SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:8;SEQ ID N0:4和SEQ ID N0:8;SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:8;SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8;SEQ ID NO:7和SEQ ID N0:8;SEQ ID N0:9和SEQ ID N0:14;沈Q ID N0:10和沈Q ID N0:14;沈Q ID N0:11 和沈Q ID N0:14;沈Q ID N0:12和沈Q ID N0:14;沈Q ID N0:13和沈Q ID N0:14;沈Q ID N0:15和沈Q ID N0:18;沈Q ID N0:16和 沈Q ID NO: 18;沈Q ID NO: 17和沈Q ID NO: 18;沈Q ID NO: 19和沈Q ID NO:33;沈Q ID NO: 20和沈Q ID N0:33;沈Q ID N0:21 和沈Q ID N0:33;沈Q ID N0:22和沈Q ID N0:33;沈Q ID NO:23和沈Q ID NO:33;沈Q ID NO:24和沈Q ID NO:33;沈Q ID NO:25和沈Q ID NO:33;沈Q ID NO:26和沈Q ID NO:32;沈Q ID NO:27和沈Q ID NO:32;沈Q ID NO:28和沈Q ID NO:32; SEQ ID N0:29和SEQ ID N0:32;SEQ ID N0:30和沈Q ID N0:32;SEQ ID N0:31 和SEQ ID N0:32;沈Q ID N0:34和沈Q ID N0:37;SEQ ID N0:35和沈Q ID N0:38;W及沈Q ID N0:36 和沈Q ID NO:39。
[0015] 在一些實施方式中，所述組合物可進一步包含選自于由如下組分所組成的組中的 反應混合物組分:緩沖液、dNTPW及DNA聚合酶。在一些實施方式中，所述組合物可進一步包 含由FFPE腫瘤樣本制備的核酸樣本。在一些實施方式中，所述組合物可進一步包含來自受 試者的腫瘤細胞，所述受試者診斷患有選自于由如下病癥所組成的組中的病癥：胃癌、腎 癌、膽管瘤、肺癌、腦癌、宮頸癌、結腸癌、頭頸部癌、肝細胞瘤、非小細胞肺癌、黑色素瘤、間 皮瘤、多發性骨髓瘤、卵巢癌、肉瘤和甲狀腺癌。在一些實施方式中，所述引物W約為實施例 1的濃度存在。
【附圖說明】
[0016] 圖1描繪了根據實施例1所述的實施方式在ICEPlex系統上對NRAS/BRAF祀標進行 多重檢測的結果。上方子圖展示了在TYE通道檢測至Ij4種BRAF祀標。下方子圖展示了在FAM通 道檢測到12種NRAS祀標。
[0017] 圖2描繪了如實施例1所述對參照基因對照進行多重檢測的結果。
【具體實施方式】
[0018] 本文所述技術的實施方式設及用于對NRAS和/或BRAF的變異(例如序列（突變）、表 達水平和/或基因拷貝數的變異)進行檢測的方法和測定法，特別是用于對NRAS和/或BRAF 的變異進行檢測的多重和多模態(mu 11 imoda 1)測定法和方法。引物組和/或引物對亞組間 的干擾是多重PCR測定法中遇到的問題。本文所述的方法和組合物至少在允許在單個反應 中對多種不同的NRAS和/或BRAF突變(例如SNP)進行高靈敏度的多重檢測且引物對之間無 顯著交叉反應方面相對現有技術做出了改進。
[0019] 已知大量不同的NRAS和/或BRAF變異，由于變異的間隔較近，甚至在一些情況下重 疊，利用現有的單反應技術對一個樣本中的此類變異組的存在和/或不存在進行區分是存 在問題的。必須將背景信號最小化，否則對于識別特定的突變而言測定法將不能可靠地工 作。
[0020] 本文使用的術語"NRAS"或"神經母細胞瘤RAS病毒癌基因同源物"指的是巧染色 體上編碼的小GlTase Ras家族蛋白。大量物種的NRAS序列為本領域所熟知，例如人NRAS (NCBI基因 10:4893;沈Q ID N0:40(NCBI Ref Seq:NM_002524;mRNA);沈Q ID N0:41(NCBI Ref Seq:NP_002515;多膚））。
[0021] 本文使用的術語"BRAF"或"V-Raf鼠類肉瘤病毒癌基因同源物護指的是與AKTl相 互作用的Raf激酶家族絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶；CRaf、HRAS和YWHAB。大量物種的 BRAF序列為本領域所熟知，例如人BRAF(NCBI基因 ID:673;SEQ ID N0:42(NCBI Ref Seq: NM_004333;mRNA);沈Q ID N0:43(NCBI Ref Seq:NP_004324;多膚））。
[0022] -方面，本文描述了用于對NRAS和/或BRAF的突變進行檢測的測定法，所述測定法 包括:將核酸樣本的部分與引物組相接觸，其中，所述引物組包含引物對亞組，其中，各引物 對擴增包含序列變異的NRAS或BRAF序列;對包含所述樣本的所述部分和一個或多個所述引 物組的反應混合物實施PCR擴增方案，所述擴增方案包括鏈分離、引物退火和引物延伸的循 環;檢測各引物對的擴增子存在或不存在，其中，擴增子的存在表明存在該引物對對其具有 特異性的序列變異。
[0023] 在一些實施方式中，所述引物中的一個或多個選自于由具有序列SEQ ID NO: 1-SEQ ID N0:39的分子所組成的組。在一些實施方式中，所述引物中的一個或多個選自于由 具有序列SEQ ID NO: I-SEQ ID NO: 18的分子所組成的組。在一些實施方式中，所述引物中 的一個或多個選自于由具有序列SEQ ID N0:19-SEQ ID N0:39的分子所組成的組。在一些 實施方式中，所述引物由具有序列SEQ ID NO: I-SEQ ID NO: 18的分子所組成。在一些實施 方式中，所述引物由具有序列SEQ ID N0:19-SEQ ID N0:39的分子所組成。
[0024] NRAS和/或BRAF的變異可被用于診斷、預后和/或治療選擇中。在一些實施方式中， 在相同的反應混合物中（例如在相同的管、孔或器皿中）對NRAS和/或BRAF的多個突變進行 檢測。在一些實施方式中，本文所述的測定法在單管中實施，例如多個引物對亞組存在于單 個反應混合物和/或器皿或容器中。因此，在所述實施方式中，單個擴增方案將提供關于多 個突變存在和/或不存在的數據。
[0025] -方面，本文所述的方法和測定法設及對NRAS和/或BRAF中序列變異的存在進行 檢測。本文使用的"序列變異"可W指替換、插入、缺失、重復或重排。在一些實施方式中，一 個或多個序列變異為點突變。
[0026] 序列變異(包括例如點突變、例如單核巧酸多態性(SNP))可W是表型上中性的，或 者可具有將其與該基因座處的優勢(predominant)序列所表