驟各自所需的條件和時間可由本領域技術人員設計。根據本文所述方法的擴增方案優選 在熱循環儀中進行，許多熱循環儀為商購可得的。
[0042] 在一些實施方式中，例如當待如本文所述對mRNA的改變進行測定時，可在本文所 述的PCR擴增方案之前對核酸樣本進行逆轉錄。逆轉錄方案和試劑為本領域所熟知，并為商 購可得的。逆轉錄方案的示例性實施方式如下:將扣L包含RNA和曲NA二者(例如25ng RNA和 2.5ng曲NA)的核酸樣本加入至反應混合物，所述反應混合物包含RT緩沖液、0.5mM dNTP、 5nM RT引物W及20單位SuperScript III?逆轉錄酶(RNA依賴型DNA聚合酶）。隨后將反應在 50°C解育30分鐘、在90°C解育5分鐘并在4°C解育5分鐘。
[0043] PCR需要使用核酸聚合酶。本文使用的短語"核酸聚合酶"指的是催化核巧S憐酸 的模板依賴型聚合，W形成與模板核酸序列互補的引物延伸產物的酶。核酸聚合酶在退火 引物的3'端起始合成，并在朝向模板5'端的方向繼續。多種核酸聚合酶為本領域所知曉并 為商購可得的。一組優選的核酸聚合酶為熱穩定的，即，其在被置于足W使得退火的互補核 酸鏈變性的溫度下（例如94°C或有時更高）維持功能。在一些實施方式中，聚合酶可為 del1:a-ex〇-Ap1:a Taq聚合酶。
[0044] 如本領域所理解的，PCR需要包含鏈分離步驟(通常設及對反應混合物進行加熱） 在內的循環。本文使用的術語"鏈分離"或"使鏈分離"意味著對核酸樣本進行處理，使得互 補的雙鏈分子分離為兩個單鏈，從而能夠用于退火至寡核巧酸引物。更具體地，根據本文所 述方法的鏈分離通過將核酸樣本加熱至高于其Tm來實現。一般而言，對于處于適于核酸聚 合酶的緩沖液中的含有核酸分子的樣本而言，加熱到94 °C足W實現鏈分離。示例性的緩沖 液含有50mM KCUlOmM hie-肥 1(25°C時抑為8.8)、0.5mM至3mM MgCl2和0.1%BSA。
[0045] 同樣如本領域所理解的，PCR需要將引物退火至模板核酸。本文使用的"退火"指的 是允許兩條互補或實質上互補的核酸鏈雜交，更具體地，當在PCR的上下文中使用時，雜交 使得形成模板依賴型聚合酶的引物延伸底物。引物-祀核酸的退火條件根據引物的序列和 長度而改變，并W所計算的引物的Tm為基礎。一般而言，擴增方案中的退火步驟設及在鏈分 離步驟后將溫度降低至W所計算的引物序列的Tm為基礎的溫度，保持足W允許此類退火的 時間。
[0046] 本領域技術人員可利用多種廣泛可得的算法中的任何算法容易地預測Tm,所述算 法例如0LIG0?(Molecular Biology Insi曲ts Inc. ,Colorado)引物設計軟件和VENTRO NTI?(Invitrogen Inc. ,California)引物設計軟件W及可在互聯網上獲得的程序（包括 PrimerS和Oligo Calculator)。例如，可用化Primer軟件（Premier Biosoft;Palo Alto, CA;并在萬維網http : //www . premierbiosof t. com/netprimer/netprlaunch/Help/ xnetprlaunch.ht ml上免費可得)對Tm進行計算。還可使用如下公式對引物的Tm進行計算 (該公式為化巧rimer軟件所使用，并在Frieir等，PNAS 198683:9373-9377中更詳細地描 述，W引用的方式將其整體并入本文）。
[0047] Tm= A H/( A S+R*ln(C/4) )+16.61og( [r ]/(1+0.7比+]) )-273.15
[004引其中，A H為螺旋形成的洽；A S為螺旋形成的賭;R為摩爾氣體常數（1997cal/°C* mol) ;C為核酸濃度；比+]為鹽濃度。對于大部分擴增方案而言，將退火溫度選擇為比預測的 Tm低約5°C，然而，可使用接近和高于Tm(例如比預測的Tm低rC-5°C，或者比預測的Tm高rC-5°c)的溫度，也可使用例如比預測的Tm低超過5°C(例如比預測的Tm低6°C、低8°C、低10°C或 更低）的溫度。一般而言，退火溫度越接近Tm,退火的特異性越高。在PCR擴增方案中允許引 物退火的時間很大程度上依賴于反應的體積(更大的體積需要更長的時間），也依賴于引物 和模板的濃度（與較低的相對濃度相比，引物相對于模板的相對濃度越高所需的時間越 少）。依賴于體積和引物/模板的相對濃度，擴增方案中的引物退火步驟可為約1秒至5分鐘， 然而通常為10秒至2分鐘、優選約30秒至2分鐘。
[0049] 本文使用的"實質上退火"指的是在PCR擴增方案過程中足W生成可檢測水平的特 異性擴增產物的退火程度。
[0050] PCR還依賴于各循環時退火引物的聚合酶延伸。本文使用的術語"聚合酶延伸"意 味著借助核酸聚合酶，W模板依賴型方式將至少一個互補核巧酸滲入至退火引物的3'端。 聚合酶延伸優選添加超過一個核巧酸、優選上至并包括對應于模板全長的核巧酸。聚合酶 延伸的條件隨聚合酶的種類而改變。聚合酶延伸所使用的溫度通常W酶的已知活性性質為 基礎。雖然退火溫度需要例如處于低于酶的最佳溫度，使用較低的延伸溫度通常是可接受 的。一般而言，雖然在低于酶的最佳延伸溫度的溫度下該酶保留有至少部分的活性，最常用 的熱穩定性聚合酶(例如Taq聚合酶和其變體)參與的聚合酶延伸在65°C-75°C、優選在約68 °C-72°C 進行。
[0051] 引物延伸在允許退火的寡核巧酸引物延伸的條件下進行。本文使用的術語"允許 退火的寡核巧酸延伸從而生成延伸產物的條件"指的是包括例如溫度、鹽與輔因子濃度、pH 和酶濃度在內的條件組，在此類條件組之下核酸聚合酶催化引物延伸。此類條件將隨所用 核酸聚合酶的種類而改變，然而用于大量有用聚合酶的條件為本領域技術人員所熟知。一 個示例性的條件組為50mM KCLlOmM Tric-肥 1(25°C時抑為8.8)、0.5mM-3mM MgCbJOOiiM 每種dNTP和0.1 % BSA，72 °C，在該條件下化q聚合酶催化引物延伸。
[0052] 在一些實施方式中，熱循環條件可與實施例1中所描述的方案一致。
[0053] 在一些實施方式中，本文所述的方法和測定法所使用的緩沖液可包含Tris緩沖 液、海藻糖、乙酸鐘、甘油、甜菜堿、氯化儀、氯化鐘、硫酸錠、DMSO、DTT、BSA、dNTP、吐溫-20和 聚合酶。在一些實施方式中，本文所述的方法和測定法所使用的緩沖液可包含IOmM-AOOmM his緩沖液(pH 7.5至9.5)、2%-20%海藻糖、10mM-300mM乙酸鐘、1 %-7.5%甘油、IOOmM-2M甜菜堿、2.5mM-l2.5mM氯化儀、ImM-IOmM氯化鐘、ImM-IOmM硫酸錠、0.1%-2%0150、1111]\1-IOmM DTT、10iig/mkl，000yg/mL BSA、50mM-400mM (1師？、0-1%吐溫-20和1個酶單位-10個 酶單位的聚合酶。
[0054] 本文使用的"擴增產物"或"擴增子"指的是由PCR反應產生的多核巧酸，該多核巧 酸是特定祀核酸序列和/或其互補序列的部分的拷貝，其核巧酸序列對應于模板核酸序列 和/或其互補序列。雖然可提及雙鏈DNA的各條鏈，本文所述的擴增產物將一般為雙鏈DNA。
[0055] 本文所述的方法利用PCR對基因突變進行定量或評估。對于本文所述的任何方法， 可通過在多個循環處從PCR反應中取出樣本，分離所取出的樣本中的擴增子并檢測擴增子 的量來實現。W運一方式測量的各擴增子的擴增譜允許對初始模板進行定量。參見例如美 國專利號8,321，140和美國專利申請號2013/0053274; W引用的方式將它們整體并入本文。
[0056] 在一些實施方式中，本文所述的方法和組合物設及多重PCR。本文使用的"多重 PCR"指的是能夠通過使用引物組中的多于一對引物(例如至少多于一種正向引物和/或多 于一種反向引物），實現在一個反應器皿中對多于一種祀核酸序列進行同時擴增，并隨后或 同時對多個產物進行檢測的PCR變型。多重擴增不僅對于檢測多個祀標的存在是有用的，對 于缺失、突變W及多態性和/或表達水平的分析、檢測和/或基因分型和/或定量測定法而言 也是有用的。多重可W指在單個反應中檢測2-1，000種不同的祀序列和/或祀核酸序列的改 變。本文使用的多重指的是在單個反應中檢測2-1，000間的任意范圍（例如5-500、25-1000 或10-100)種的不同祀序列等。W非限制性實例的方式，作為本文所述方法的一部分的多重 PCR反應能夠在單個反應中對至少兩個不同的等位祀點基因座處的至少兩個SNP的兩種W 上可能的等位基因的存在進行肯定性檢測。當用于PC則寸，術語"多重"隱含了在同一PCR反 應中存在特異性針對至少兩種不同的祀序列的引物。因此，即便在給定樣本中實際檢測到 的僅是所述至少兩種祀序列中的一種(或甚至沒有），認為其中存在特異性針對兩種不同的 祀序列的引物組的反應為多重擴增。因此，在一些實施方式中，多重PCR也可W指包含多對 引物的反應，其中，當反應中存在一種或多種祀標時，所述反應可產生一種或多種特異性擴 增產物。
[0057] 例如，可通過在擴增反應期間或之后的任何時間進行重復采樣，隨后對擴增產物 進行分離和檢測，從而促進定量運個方面。采樣例如可包括移出反應的等分試樣 (aliquot)。采樣可在例如每個循環結束或者在每數個循環(例如每兩個循環、每=個循環、 每四個循環等)結束時發生。雖然均勻采樣間隔是最常期望的，并不要求采樣W均勻間隔實 施。僅作為一個實例，采樣程序可設及在最初的五個循環的每個循環后采樣，隨后在每隔一 個循環后采樣，反之亦然。
[0058] 可利用數種不同通用模式中的任意模式實施從擴增反應中對等分試樣的采樣或 配分(dispensing)。采樣或移出方法可依賴于多種因素中的任意因素，包括但不限于可用 的設備、待分析的樣本數W及檢測相對于樣本收集的時機(例如同時VS.連續）。移出或擠出 樣本的確切方法并不必然對本文所述的方法構成限制。特別是在高通量應用中，優選利用 自動化設備進行采樣。還可通過從PCR反應直接電動注射或流體動力學注射至毛細管電泳 設備中來進行采樣。本發明方法中使用的采樣方法優選適合于盡可能減少循環反應中的污 染，例如通過使用在取出單個等分試樣后棄去的移液管頭或針，或者通過使用相同的頭或 針來配分來自同一 PCR反應器皿的樣本。同時采樣和檢測的方法為本領域技術人員所知曉 (參見例如美國專利申請公開2004/0166513, W引用的方式并入本文）。
[0059] 采樣步驟所配分的核酸的量和/或等分試樣的體積可根據例如擴增反應的總體 積、產物檢測的靈敏度W及所使用的采樣和/或分離類型而改變。擴增體積可在數微升至數 百微升間變化(例如扣1、IOyl、2化1、40山、60山、80山、100山、120iU、150iU、或20化1 W上）， 優選在IOyl-ISOiil范圍內、更優選在IOiil-IOOiil范圍內變化。擴增反應的確切體積并不限 制本發明。等分試樣的體積可在反應混合物的0.0 l %-30 %間變化。電動注射至毛細管電泳 通常將核酸加樣至毛細管，但不明顯降低被采樣反應的體積。可在多個獨立的核酸擴增混 合物中實施擴增方案，任選地在多孔容器中進行。在其中進行擴增反應的容器并不必然限 制本文所述的方法。
[0060] 在多個實施方式中，本文所述的方法和組合物設及對各個祀核酸序列（例如對各 個祀改變)的擴增產物(例如擴增子)進行檢測。在一些實施方式中，對各個祀核酸序列的擴 增產物的檢測肯定性地表明樣本中該祀核酸序列的存在。在一些實施方式中，對各個祀核 酸序列的擴增產物的定量檢測表明樣本中該祀核酸序列的水平。
[0061] 在一些實施方式中，本文所述的方法和組合物設及兩個W上引物對亞組的擴增產 物，所述擴增產物彼此間應是可區分的。在一些實施方式中，本文所述的方法和組合物設及 PCR擴增方案，其中，可借助有區別的大小將兩個W上引物對亞組的擴增產物區分開。如本 文所使用的，如果能夠從具有不同大小(different size)的核酸中將其分辨出，則該核酸 具有"有區別的大小"。"不同大小"指的是長度至少存在一個核巧酸的差異的核酸分子。一 般而言，對于本文所述方法有用的具有有區別的大小的擴增產物的核巧酸數量差異高于或 等于給定分離或檢測方法中使用的分離過程的分辨極限。例如，當分離的分辨極限是一個 堿基時，具有有區別的大小的擴增產物的長度具有至少一個堿基的不同，但也可W具有2個 堿基、5個堿基、10個堿基、20個堿基、50個堿基、100個堿基或更多堿基的不同。當分辨極限 是例如10個堿基時，具有有區別的大小的擴增產物將具有至少10個堿基的不同，然而也可 W具有11個堿基、15個堿基、20個堿基、30個堿基、50個堿基、100個堿基或更多堿基的不同。
[0062] 在一些實施方式中，引物或其任意部分的長度及與其退火的祀核酸序列的片段的 長度均可改變。所擴增的祀序列長度的變化(例如通過將正向引物和反向引物的位置選擇 為彼此更遠離或更接近)是保證使來自不同祀標的產物之間易于區分的直接方法。引物長 度的變化(特別是雙結構域引物的5'尾區長度的變化)對于例如在測定法中將給定祀基因 座的特定等位基因的產物區分開而言是特別有效的。
[0063] 在一些實施方式中，通過用不同的可檢測標記物進行標記，將擴增產物區分開。在 一些實施方式中，將標記物滲入至引物。在一些實施方式中，將標記物綴合至引物。
[0064] 在一些實施方式中，在PCR擴增方案完成后，標記物結合至引物。在一些實施方式 中，標記物綴合至與引物特異性結合的抗體或其部分或寡核巧酸、或者綴合至附著至引物 的部分(moiety)。
[0065] 如果來自一種標記物的信號能夠與來自另一種標記物的信號相區別，認為兩種可 檢測標記物不同。可檢測標記物可包括例如吸光染料、巧光染料或放射性標記物。巧光染料 是優選的。一般而言，如果巧光信號與另一巧光信號的峰值發射波長分開有至少20nm，則該 巧光信號與另一巧光信號是可區分的。與窄峰或更睹峭的峰相反，特別是當給定反應中巧 光團的發射峰較寬時，更大的峰間隔是優選的。
[0066] 可檢測標記物、對所述可檢測標記物進行檢測的方法W及將所述可檢測標記物滲 入或偶聯和/或結合至擴增產物的方法為本領域所熟知。W非限制性實例的方式提供W下 內容。
[0067] 在一些實施方式中，可檢測標記物可包括能夠通過光譜學、光化學、生物化學、免 疫化學、電磁、放射化學或化學手段(如巧光、化學巧光或化學發光)或任何其它適當的手段 檢測的標記物。
[006引本文所述方法中使用的可檢測標記物可為一級(prima巧)標記物(其中，該標記物 包含可直接檢測的部分或產生可直接檢測部分的部分)或二級（seconda巧)標記物(其中， 該可檢測標記物結合至產生可檢測信號的另一部分，例如，如在免疫標記中常見的使用二 抗和=抗）。
[0069] 可借助共價或非共價手段將可檢測標記物連接至核酸。或者，可通過例如對經由 配體-受體結合對設置實現與另一核酸的結合的分子或其它此類特異性識別分子進行直接 標記而將可檢測標記物連接。可檢測標記物可包括但不限于放射性同位素、生物發光化合 物、發色團、抗體、化學發光化合物、巧光化合物、金屬馨合物和酶。
[0070] 在一些實施方式中，可檢測標記物可為巧光染料分子或巧光團，包括但不限于巧 光素、藻紅蛋白、Cy3?、Cy5?、別藻藍蛋白、德克薩斯紅（Texas red)、多甲藻素葉綠素 (peridinin chlorophyll)、青色素(cyanine)、串聯綴合物(例如藻紅蛋白-切5?)、綠色巧 光蛋白、羅丹明、異硫氯酸巧光素(門TC)和化egon Green?、羅丹明及衍生物(例如德克薩斯 紅和四甲基異硫氯酸羅丹明（TRITC))、生物素、藻紅蛋白、AMCA、CyDyesTM、6-carbo巧thiorescein(-般W縮寫FAM和F表示）、6-簇基-2 '，4 '，7 '，4，7-六氯巧光素化EX)、 6-簇基-4'5'-二氯-2'7'-二甲氧基巧光素（J0E或J)、N，N，N'，N'-四甲基-6簇基羅丹明 (TAMRA或T)、6-簇基-X-羅丹明（ROX或R)、5-簇基羅丹明-6G(R6G5或G5)、6-簇基羅丹明-6G (R6G6或G6)W及羅丹明110;青色素染料，例如Cy3、C巧和染料；香豆素，例如傘形酬 (umbel 1 iferone);苯甲酯亞胺染料，例如Hoechst 33258;菲晚（phenanthridine)染料，例 如德克薩斯紅；乙錠(ethidium)染料;日丫晚染料;巧挫染料;吩嗯嗦染料；日h嘟染料;多甲川 (polymethine)染料，例如青色素染料(如Cy3、Cy5等）；B0DIPY染料和哇嘟染料。
[0071] 在一些實施方式中，可檢測標記物可為放射性標記物，包括但不限于化、i25I、 35S、 14C、32p 種 3p。
[0072] 在一些實施方式中，可檢測標記物可為酶，包括但不限于辣根過氧化物酶和堿性 憐酸酶。酶標記物可W產生例如化學發光信號、有色信號或巧光信