B加入20yL 2 X蛋白質上樣buffer，煮沸5min，14000rpm離心3min〇 [0104] 3 ·處理沉淀
[0105] 在沉淀中加入500yL PBS重懸菌體，取80yL重懸菌液加入20yL 5X蛋白質上樣 buffer，煮沸 5min，14000rpm 離心 3min。
[0106] 4.SDS-PAGE 電泳
[0107] 將5%濃縮膠灌入制膠版中，在加入蒸餾水將膠壓平，室溫放置30min使其凝固，將 上層的蒸餾水倒干，再灌入10%分離膠，立即插上梳子，室溫放置30min使其凝固備用。將處 理好的上清和沉淀分別取10yL上樣，進行SDS-PAGE電泳。電壓先80v電泳30min，再調至 180v，電泳1~2h后，將膠取出，置于考馬斯亮藍染色液中振蕩染色，再置于脫色液中振蕩脫 色后，在呈像系統下觀察結果，PGEX-6P-2-〇prL/XL-lblue在30°C為可溶性蛋白（圖3)。 [0108]實施例3:重組蛋白Vac9抗原的制備
[0109] 1.放大培養獲取蛋白
[0110] 取保存在4°C冰箱中備用的pGEX-6P-2-〇prL/XL-lblue菌液400yL加入到20mL含 Amp抗性的LB培養基中進行一次活化，200rpm 37°C培養5~6h后，取8mL-次活化的菌液加 入到400mL含Amp抗性的LB培養基中進行二次活化，37 °C培養3~4h至0D600為1.0時，加入80 yL IPTG(終濃度為200μΜ)置于16°C搖床中過夜誘導后，12000rpm離心15min收集菌體，再加 20mL lysis buffer(同實施例2)重懸菌體后，將菌液進行超聲裂解3min(200V)，收集上清 與800yL用于結合GST融合蛋白的Glutathione Sepharose 4B(GE公司）凝膠珠(beads)結合 處理;再進行SDS-PAGE凝膠電泳。 2.使用酶切方法，將目的蛋白和GST標簽分開，獲取OprL目的蛋白 [0112]向余下約800yL已結合蛋白的Glutathione Sepharose 4B中加入800yL PBS和120 yL PreScission protease(PP酶，GE公司），室溫垂直旋轉酶切5h后，離心吸取上清后，分別 用800yL PBS洗滌3次，各后取10yL樣品變性處理后，上樣5yL進行蛋白電泳(方法同上），在 呈相系統下觀察結果，酶切下來的OprL蛋白分子量~16kDa，與預期蛋白分子量大小相符 合，見圖4。
[0113] 實施例4重組融合蛋白Vac9的純化
[0114] 4.1高壓破菌、離心
[0115] 將上述的銅綠假單胞菌(PA)疫苗重組蛋白Vac9(0prL)通過高密度發酵，離心收集 菌體備用。
[0116] 菌體200-500g 以 PBS(10-20mM，pH7.0-7.5)緩沖液，按重量(g):體積(ml)比 1:5-10 比例混勻懸浮，4°C預冷。
[0117] 高壓均質：低溫循環系統開啟預冷至1-4°C，用蒸餾水沖洗高壓均質機管道。預冷 的懸浮菌液加入高壓均質機，壓力維持在60-80Mpa破菌3-5次，取破菌液涂片進行結晶紫染 色，油鏡下每個視野下未破碎菌小于2個視為破菌完全。
[0?18] 高速離心:破菌后的液體裝入離心桶，4°C，10，000-15,00(^離心15-30111；[11，收集上 清備用。
[0119] 4.2 GST親和純化
[0120] 選擇GST親和層析填料進行初步純化，GST親和填料為GST-瓊脂糖凝膠4B、GST-瓊 脂糖凝膠4FF、GST-瓊脂糖凝膠HP之一，破菌菌體濕重每100g，填料用量為10〇1111。使用1〇-20mM Na2HP〇4-NaH2P〇4，lM NaCl，pH7.0-7.5緩沖液（取Na2HP〇4.12H2〇 4g，NaH2P〇4.2H2〇 lg， NaCl 58.5g加 I級水900ml溶解完全，調pH值至7.2，加 I級水定容至1L)對未結合蛋白進行沖 洗。
[0121 ] PP酶進行酶切洗脫:重組蛋白Vac9帶有GST標簽，在蛋白與標簽之間有一個酶切位 點，而PP酶會針對這一酶切位點發生作用，把目的蛋白切下，而自身結合在標簽上，從而達 到酶切分離目的蛋白的效果，故選用PP酶酶切目的蛋白，再用10-20mM Na2HP〇4_NaH2P〇4， pH7 · 5緩沖液(取Na2HP〇4 · 12H20 4 · 5g，NaH2P〇4 · 2H20 0 · 5g加 I 級水900ml溶解完全，調pH值至 7.5，加 I級水定容至1L)洗脫，獲取Vac9目的蛋白，電泳結果如圖4所示。
[0122] 4.3樣品處理
[0123] 實施例4.2目標蛋白洗脫液與A緩沖液(20mM PB，3M(NH4)2S〇4，pH7.5)按體積比1:2 進行混合，A緩沖液向蛋白溶液滴加，邊滴邊攪拌。
[0124] A緩沖液的配制：（取Na2HP〇4.12H2〇 4.5g，NaH2P〇4.2H2〇 0.5g，（NH4)2S〇4 396g，加 I 級水900ml溶解完全，調pH值至7.5,加 I級水定容至1L)。
[0125] 4.4 Phenyl HP層析純化
[0126] 用8緩沖液(20禮？8,21(順4)23〇4 4117.5)平衡層析系統及?1161^1冊層析柱，上樣 實施例4.3收集的樣品，上樣流速15ml/min，上樣體積1800ml，上樣完畢后用B緩沖液沖洗未 結合蛋白，直至基線平穩，再用〇_1〇〇%(：緩沖液(2〇11111^，？!17.5)線性梯度洗脫，洗脫流速 15ml/min，洗脫體積5個柱體積，收集目的蛋白峰Peakl，保存于4 °C備用。層析圖如圖5所示， 電泳結果如圖8所示。
[0127] B緩沖液的配制：（取Na2HP〇4.12H2〇 4.5g，NaH2P〇4.2H2〇 0.5g，（NH4)2S〇4 264g，加 I 級水900ml溶解完全，調pH值至7.5,加 I級水定容至1L)。
[0128] C緩沖液的配制：（取Na2HP〇4.12H20 4.5g，NaH2P〇4.2H20 0.5g加 I級水900ml溶解完 全，調pH值至7.5,加 I級水定容至1L)。
[0129] 4.5 G 25層析純化
[0130] 用0緩沖液（10禮1^-組氨酸，0.9%恥(：1，0.1%1'竹丨〇11叉-100印!16.0)平衡層析系 統及G 25層析柱，將實施例4.4收集的樣品上樣，上樣流速15ml/min，上樣體積120ml，上樣 完畢后用D緩沖液洗脫，置換緩沖液，收集流穿下來的目的蛋白保存在4°C備用，層析圖如圖 6所示。
[0131] 0緩沖液的配制：（取1^-組氨酸0.7758，氯化鈉注射液5001111，1^切111-1000.51111， 調pH值至6.0)。
[0132] 4.6 Q HP層析純化
[0133] 先用1M NaOH溶液在位清洗，再用D緩沖液平衡層析系統及層析柱，上樣實施例4.5 層析純化獲得的樣品，上樣流速5ml/min，上樣體積150ml，收集流穿，即為目的蛋白，保存于 4°C備用。由此，獲得的樣品為最終目的蛋白，即純化的Vac9抗原原液。層析圖如圖7所示，電 泳結果如圖9所不。
[0134] 4.7 HPLC檢測
[0135] 使用C3 (購自Agi lent公司）對Vac9蛋白進行純度檢測，用0.1 % TFA水溶液平衡柱 子，上樣lOul樣品，Ο . 1 %TFA乙腈溶液洗脫，設定柱溫60°C，流速Ο . 5ml/min。洗脫程序為： 10%~100%B，30min，通過曲線測出Vac9蛋白的純度，層析圖如圖10所示。
[0136] 0.1 %TFA水溶液的配制：1LI級水加 lmlTFA混勻，0.22μπι濾膜過濾。
[0137] 0.1 % TFA乙腈溶液的配制：1L乙腈加 lmlTFA混勻。
[0138] 純化后的抗原，做以下實驗：
[0139] 實施例5免疫動物
[0140] 1)首次免疫，用PBS稀釋Vac9蛋白抗原，加入濃度為lmg/mL的A1(0H)3;用5號半型 針頭，雙側腹股溝、足底及背部皮下對點注射，每只BALB/C小鼠注射量為lOOyL，并設置陽性 對照組、陰性對照組和空白對照組；
[0141] 2)第二次免疫，第7天進行第二次免疫，免疫組分同上，注射量蛋白抗原量是首次 免疫的1/2，免疫途徑冋上；
[0142] 3)第三次免疫，第14天進行第三次免疫，免疫組分同上，注射量蛋白抗原量與第二 次免疫相同，免疫途徑同上；
[0143] 實施例6抗體的檢測
[0144] 第三次免疫后第7和14天，采集BALB/C小鼠的血，用ELISA檢測小鼠免疫后，IgG、 IgGl、IgG2a體液應答水平。
[0145] 1.制備液體
[0146] 1)包被液的配制：稱取NaHC03 1.6g，Na2C03 2.9g，溶于1L ddH20,用pH計將