銅綠假單胞菌疫苗重組蛋白Vac9的純化方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物制藥領域，具體涉及銅綠假單胞菌(PA)疫苗重組蛋白Vac9(0prL) 的純化方法。
【背景技術】
[0002] 銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)俗稱綠膿桿菌，為非發酵菌中的假 單胞菌屬，廣泛分布于自然界、正常人皮膚、腸道、呼吸道中，在醫院病房及醫療器械中也普 遍存在，是臨床上最為常見的條件致病菌之一。由于PA在臨床上的高感染率和耐藥率的不 斷攀升，尋找新的"非抗生素療法"迫在眉睫，從免疫學角度入手，研制開發出安全有效的疫 苗成為最為理想的選擇。
[0003] OprL為銅綠假單胞菌的肽聚糖相關蛋白（pep t i dog 1 y can as soc i ated lipoprotein)，其位于銅綠假單胞菌的外膜，在細菌的生理和病理過程中發揮重要的作用。 OprL蛋白在銅綠假單胞菌中高度保守，已經有研究將其作為銅綠假單胞菌的診斷靶點(Xu， J.等.Clin .Microbiol .Ant imicrob. 2004)。同時有研究發現在病人的血清中發現有抗OprL 的抗體的存在(Montor，W. R等，Infect Immun 2009)，此外OprL還能誘導小鼠產生保護性 Thl7免疫應答反應(Wu，W等，Am J Respir Crit Care Med 2012)。鑒于這些因素，OprL可以 作為良好的基因工程疫苗候選抗原。
[0004] 申請人采用基因工程技術克隆通過大腸桿菌基因工程菌表達獲得銅綠假單胞菌 (PA)疫苗重組蛋白Vac9(0prL)，所述重組蛋白經動物試驗證明，可有效刺激機體產生較高 的體液免疫應答和良好的免疫保護作用，有利于銅綠假單胞菌的預防、診和治療。目前，尚 未見針對該重組蛋白Vac9的純化方法的報道。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是提供一種銅綠假單胞菌(PA)重組亞單位基因工程蛋白Vac9的純 化方法。該方法工藝簡單，所獲得目標蛋白純度高，容易放大、重復性好，回收率較好。
[0006] 本發明的技術方案是：
[0007] 一種銅綠假單胞菌亞單位重組基因工程疫苗抗原Vac9,其核酸序列如SEQ ID N0: 1所示，氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
[0008] 銅綠假單胞菌亞單位重組基因工程疫苗抗原Vac9的純化方法，包括以下步驟：
[0009] 1)收集構建表達基因工程蛋白Vac9的大腸桿菌工程菌高密度發酵的菌體；
[0010] 2)將步驟1)收集的菌體破菌，離心，收集上清；
[0011] 3)將步驟2)得到的上清液通過GST親和層析進行親和純化;其中，在所述親和層析 中緩沖液洗脫使用Prescission Protease酶進行酶切；
[0012] 4)步驟3)處理后的重組蛋白Vac9用A液進行樣品處理；
[0013] 5)步驟4)處理后的重組蛋白Vac9進行Phenyl HP層析柱純化，其中，使用B液平衡 層析系統及Phenyl HP層析柱，用C液線性梯度洗脫；
[0014] 6)將步驟5)純化后的重組蛋白Vac9進行G25層析柱純化;其中，采用D液平衡G25層 析系統及層析柱，分離純化重組蛋白，置換緩沖液；
[0015] 7)將步驟6)純化后的重組蛋白Vac9進行Q HP去內毒素，其中，在D緩沖液平衡層析 系統及Q HP層析柱內去除內毒素，分離純化重組蛋白Vac9;
[0016] 其中，A液為ρΗ7·5的含20mM ro，3M(NH4)2S〇4的緩沖液，B液為ρΗ7·5的含20mM PB， 2M(NH4)2S〇4緩沖液；C液為的pH 7.520mM 1?溶液;D液為ρΗ6·0的含10mM L-組氨酸，0.9% NaCl，0.1%Trtion x-100緩沖溶液。
[0017] 步驟2)的具體方法是將培養的細菌以PBS (10-20mM，pH7.0-7.5)緩沖液懸浮，預冷 后采用高壓均質破菌，在4°C條件下，10,000-15,000g高速離心15-30min，收集上清，所述的 高壓均質破菌壓力為60_80MPa，；
[0018] 步驟3)所述GST親和純化方法是:先用GST親和填料進行初步結合，接著用10-20mM Na 2HP〇4_NaH2P〇4,1M NaCl pH7 · 0-7 · 5緩沖液清洗，再用PP酶進行酶切，最后用10-20mM Na2HP〇4_NaH2P〇4，pH7.0-7.5緩沖液對目標蛋白進行洗脫;所述GST親和層析使用的填料為 GST-瓊脂糖凝膠4B或GST-瓊脂糖凝膠4FF或GST-瓊脂糖凝膠HP。
[0019] 步驟4)所述的樣品處理是：步驟3)所得重組蛋白Vac9與A液按體積比1:2進行混 合，A液滴加到重組蛋白Vac9溶液，邊滴邊攪拌。
[0020] PP酶會針對目的蛋白與GST標簽間的酶切位點發生作用，而自身與GST標簽結合， 從而達到酶切分離目的蛋白的效果；
[0021] 步驟5)所述的Phenyl HP層析純化是：用財夜平衡層析系統及Phenyl HP層析柱，上 樣步驟4)處理后的樣品，上樣后用B液沖洗未結合蛋白，直至基線平穩，再用C液線性梯度洗 脫；其中，Phenyl HP層析柱的填料為Phenyl Sepharose HP或Phenyl Sepharose 6FF或 Capto Phenyl ImpRes〇
[0022] 步驟6)所述的G 25層析是：用D液平衡層析系統及G 25層析柱，將步驟5)純化獲得 的樣品，上樣，分離純化重組蛋白Vac9,置換緩沖液;其中G 25層析柱的填料為Sephadex G-25Coarse或Sephadex G_25Medium或Sephadex G_25Fine或Sephadex G_25Superfine〇
[0023] 步驟7)所述的Q HP去內毒素是：先用1M NaOH溶液在位清洗，再用D緩沖液平衡層 析系統及Q HP層析柱，上樣步驟5)純化獲得的樣品，去除痕量非目標蛋白，內毒素等雜質， 分離純化目標蛋白-重組蛋白Vac9,其中，所述的層析柱的填料為Q Sepharose HP或Q Sepharose FF或Capto Q〇
[0024] 上述純化方法所述抗原Vac9采用以下方法制備：
[0025] 1)設計正向引物和反向引物通過PCR擴增或全基因合成獲得銅綠假單胞菌亞單位 重組基因工程疫苗候原Vac9蛋白片段的核苷酸序列；
[0026] 2)將步驟1)獲得的核苷酸序列克隆表達至表達載體構建重組載體，然后將該重組 載體轉化至宿主菌；
[0027] 3)誘導轉換后的宿主菌表達重組蛋白。
[0028]發明效果
[0029]采用本發明所述的純化方法，從表達銅綠假單胞菌(PA)重組亞單位基因工程蛋白 Vac9的大腸桿菌工程菌中可以獲得純度大于98%，回收率大于30%的目的蛋白。通過氨基 酸序列預測該基因工程蛋白等電點在pH 5.73左右，分子質量約為15.8kDa。
[0030] 本發明所述的純化方法主要有GST純化、Phenyl HP層析、G 25層析、Q HP層析去內 毒素，通過上述方法純化獲得的Vac9原液用12% SDS-PAGE鑒定，電泳結果呈現單一目標蛋 白條帶，分子質量約為16kDa APLC C3柱分析目的蛋白純度97.8 %。純化后的Vac9與氫氧化 鋁佐劑共同注射免疫BalB/C小鼠，檢測結果顯示，血清中IgG水平顯著高于陰性對照組(PBS 組）（P<0.01)，表明本發明人純化獲得的Vac9與氫氧化鋁佐劑共同刺激機體，可產生較高 的免疫應答。使用臨床株XN-1(CCTCC Μ 2015730)感染，發現Vac9加免疫佐劑組感染率為 30%，對照組(PBS組)感染率為80%，計算得出Vac9抗PA感染的保護率為62.5%。
[0031] 本發明所述純化方法工藝簡捷、容易放大、重復性好，所獲目標蛋白純度高，動物 試驗證明可有效刺激機體產生較高的體液免疫應答和良好的免疫保護作用。
【附圖說明】
[0032]圖1為OprL基因片段的PCR擴增結果；其中，泳道1 :核酸（DNA)分子量標準 (Marker)，從上到下大小分別為:4500、3000、2000、1200、800、500、200bp;;泳道2:目的基因 片段OprL(~450bp);
[0033] 圖2為重組質粒pGex-6P-2-〇prL的雙酶切鑒定結果;其中，泳道1:核酸(DNA)分子 量標準(Marker)，從上到下大小分別為:4500、3000、2000、1200、800、500、200bp;泳道2~6: 重組表達質粒pGEX-6p-2-〇prL經酶切后的鑒定結果，酶切后分離的片段約4000bp和約 450bp；
[0034] 圖3為蛋白OprL誘導鑒定結果；其中，泳道1:蛋白分子量標準(Marker)，從上到下 大小分別為：170Kd、130Kd、1 OOKd、70Kd、55Kd、40