Kd、35Kd、25Kd、15Kd、1 OKd;泳道 2&3:結合 誘導表達的超聲上清的GST填料;泳道4:經PP酶酶切后的上清;泳道5:經PP酶酶切后的GST 填料；
[0035]圖4為純化后的蛋白OprL SDS-PAGE電泳結果，其中，泳道1:蛋白分子量標準 (Marker)，從上到下大小分別為：170Kd、130Kd、100Kd、70Kd、55Kd、40Kd、35Kd、25Kd、15Kd、 10Kd;泳道2:純化的OprL蛋白；
[0036] 圖5為Phenyl HP層析圖；
[0037] 圖6為G 25層析圖；
[0038]圖7為Q HP層析圖；
[0039]圖8為GST親和PP酶酶切、Phenyl HP層析后SDS-PAGE結果，圖中，泳道1:目的蛋白 與GST填料結合后;泳道2: PP酶酶切后的GST填料;泳道3: PP酶酶切后洗脫樣品；泳道4: PP酶 酶切后洗脫樣品（含2M(NH4)2S〇4);泳道5 : Phenyl HP層析上樣流穿；泳道6 :蛋白分子量 marker;泳道7-10: Pheny 1 HP層析洗脫樣品1 -4;
[0040] 圖9為Q HP層析去內毒素后SDS-PAGE結果，圖中，泳道Μ:蛋白分子量marker;泳道 1:Q HP層析去內毒素流穿樣品；
[0041] 圖10為最終樣品的HPLC純度檢測圖(①為目的蛋白峰，②為系統峰）。
【具體實施方式】
[0042] 為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對 本發明進一步詳細說明。應當理解，此處說描述的具體實施例僅用以解釋本發明，并不用于 限定本發明。
[0043]菌株與各種試劑如下：
[0044] 1.銅綠假單胞菌菌株
[0045] 銅綠假單胞菌國際標準株PA01由美國ATCC提供(ATCatBAA-47TM);
[0046] 2.試劑
[0047] 質粒pGEX_6p_2購自GE Healthcare Life Sciences公司，申請人保存；
[0048]大腸桿菌菌株XL-1 blue購自上海超研生物科技有限公司，申請人保存；
[0049] primeSTAR HS DNA Polymerase、DNA Marker、限制性內切酶BamH I和EcoR I、蛋 白Marker為大連TakaRa公司產品；
[0050] 質粒提取試劑盒和凝膠回收試劑盒為美國Omega公司產品；
[0051 ] Na2HP〇4.12H20、NaH2P〇4.2H20、NaCl、NaOH、吐溫 20、硫酸銨、碳酸氫鈉、碳酸鈉均購 自國藥集團化學試劑有限公司；
[0052] PBS購自北京中杉金橋生物技術有限公司；
[0053] Tryptone、Yeast extract均購自英國0X0ID公司；
[0054 ] Amp icilline、氯化鈉注射液購自太極集團西南藥業；
[0055] IPTG、L-組氨酸、Triton x-100購自生工生物工程(上海)股份有限公司；
[0056] 蛋白上樣緩沖液購于碧云天生物技術;蛋白Marker購于Thermo公司；
[0057] TFA、乙腈購自TEDIA公司；
[0058] A1(0H)3 購自 Brenntage 公司；
[0059] Tris 購自 ANGUS 公司；
[0060]硫酸購自成都科龍化工試劑廠；
[0061 ] 牛血清白蛋白V購自BI0SHARP公司；
[0062] 異氟烷購自深圳市瑞沃德生命科技有限公司。
[0063] 下面結合實例對本發明作詳細描述：
[0064] 實施例1:0prL基因的克隆和重組質粒pGEX-6P-2-〇prL的構建
[0065] 1.首先根據銅綠假單胞菌PA01的OprL蛋白全長基因序列，應用生物信息軟件進行 結構分析，確定需要擴增的OprL目的基因片段。
[0066] 2.根據分析結果，采用PCR方法自PA01基因組擴增OprL目的基因片段，擴增步驟如 下：
[0067] 1)設計PCR引物如下，分別為SEQ ID N0:3-4(下劃線示酶切位點堿基序列） 「00681
[0069] 2) -80 °C冷凍庫中取出保存的銅綠假單胞菌菌株ΡΑ01涂布于LB固體培養基上，于 37 °C培養過夜，再挑取單菌落接種于LB液體體培養基中培養8個小時，參照細菌基因組抽提 試劑盒抽提PA01基因組。
[0070] 3)以PA01全基因組DNA為模板PCR擴增OprL基因片段
[0071] PCR 體系：
[0072]
[0073] ?0財廣增反應條件98°(：預變性51^11，98°(：變性308,55°(：退火308,72°(：延伸908,30 個循環，72°C完全延伸6min。反應完畢后使用1%的瓊脂糖凝膠檢測PCR擴增結果，PCR擴增 結果示于圖1中。
[0074] 4)使用凝膠回收試劑盒回收OprL PCR產物。
[0075] 3.PCR產物的鑒定與克隆，步驟如下：
[0076] l)BamH I和EcoR 頂每切pGEX-6P-2質粒和OprL PCR產物 [0077]酶切反應體系：
[0078]
[0079]
[0080] 37。(：酶切211。
[0081 ] 2)使用超薄回收試劑盒回收pGEX-6P-2質粒和經BamH I和EcoR頂每切的PCR產物。 [0082] 3)連接和轉化
[0083] 通過紫外分光光度計測定OprL酶切回收產物核酸濃度：21ngAU，pGEX-6P-2酶切 回收產物核酸濃度:60ngAU。
[0084]連接反應體系：
[0085]
[0086] 混勻，16Γ 連接 2h。
[0087] 4)從-80°C冰箱取3管大腸桿菌XLlblue感受態細胞，第一管加入pGEX-6P-2質粒， 作陽性對照；第二管加入DNA連接產物;第三管不加外源DNA，作陰性對照。冰浴50min，42 °C 金屬浴中熱擊90s，迅速冰浴2min。加入600ul LB空白培養基，混勻，置于37°C搖床中220rp 振搖lh。
[0088] 各管以5000rpm室溫離心3min.，棄去300ul上清，再重懸菌體，取200μ1涂布于Amp 抗性LB平板。平板倒置于37 °C培養箱中培養24h。
[0089] 5) pGEX-6p-2-〇prL陽性重組質粒的篩選、鑒定
[0090]①陰性對照平板沒有菌落出現；陽性對照平板長滿菌落，說明感受態細胞制作正 確，結果可信。挑取轉化平板上分隔良好的菌落，接種于Amp抗性LB培養基中，37°C振蕩培養 過夜；
[0091] ②質粒抽提:參照質粒提取試劑盒說明書進行；
[0092] ③質粒DNA進行BamH I和EcoR I雙酶切；
[0093]雙酶切反應體系：
[0094]
[0095] 37。(：酶切211;
[0096] ④1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測雙酶切結果，結果如圖2,可見泳道2樣品為構建成功 的pGEX-6p-2-〇prL重組質粒；
[0097] ⑤pGEX-6p-2-〇prL重組質粒送往上海英俊公司測序，測序結果比GeneBank序列信 息比對，結果發現二者的序列核苷酸序列完全相同。
[0098] 實施例2:重組融合蛋白Vac9在原核表達系統-大腸桿菌中誘導表達及表達形式的 鑒定
[0099] 1.重組蛋白Vac9誘導表達
[0100] 取過夜培養的pGEX-6P-2-〇prL/XL-lblue菌液100yL加入10mL Amp+抗性的LB培養 基中，180rpm 37°C過夜培養，分別取過夜培養的菌液400yL加入20mL Amp+抗性的LB培養基 中（余下的菌液保存在4 °C冰箱中備用），37 °C培養2~3h，轉速200rpm，二次活化至0D600為 0.8-1.0時，加入IPTG 4yL，使其終濃度為200μΜ，再置于搖床誘導表達30°C誘導表達3h。 [0101] 2)將誘導表達后的菌液取出，以12000rpm離心5min，棄去上清，加入lmL lysis buffer(20mM PB，pH 7.2,250mM Nacl)混勻，超聲裂解3min(超聲6次30s/次），再4°C 14000rpm離心15min，分離上清和沉淀。
[0102] 2.處理上清
[0103] 取Glutathione Sepharose 4B 20μ1，用PBS洗滌3次后，將準備好的上清加入 Glutathione Sepharose 4B中，室溫結合lh。在4°C下以 14000rpm離心3min后，使用PBS-0.25%吐溫20洗滌2次，PBS洗滌一次。向結合后的Glutathione Sepharose 4