綴合物從細胞中釋放，因 此將化pes緩沖液(pH7.4)用作運行緩沖液-2。然而，使用包含每一種免疫球蛋白片段-蛋白 質綴合物(其稀釋在運行緩沖液-1中）的樣品，對化Rn和每一種免疫球蛋白片段-蛋白質綴 合物之間的結合誘導4分鐘，然后使用運行緩沖液-2對每一種免疫球蛋白片段-蛋白質綴合 物與化化的解離誘導1分鐘。免疫球蛋白片段-蛋白質綴合物的傳感圖顯示在圖3中。免疫球 蛋白片段-蛋白質綴合物與化化的解離度表示為根據下列等式2的結合比率（％)。此處，在 P冊.0樣品注射完成之前2秒測量的共振單位被選擇作為與在抑6.0下結合的量成比例的物 理量，并且在抑7.4下解離開始后10秒測量的共振單位被選擇作為與在抑7.4下結合的量成 比例的物理量。利用所選的共振單位，根據下列等式2計算結合比率： 巧142] 等式2
[0143] 結合比率（％) =(在pH7.4下結合的量/在P冊.0下結合的量）X 100。
[0144] 如本文使用的，術語"結合比率"是指免疫球蛋白片段-蛋白質綴合物容易與FcRn 解離的程度。可見，結合比率的值越小，在中性抑下綴合物的解離越好，并且綴合物的化化- 介導的再循環越容易發生，反之，結合比率的值越大，在中性pH下綴合物的解離不充足，所 W即使當通過結合至Fc化而被內吞時，綴合物更可能通過溶酶體降解除去。
[0145] 結果，如圖2和3中所示，實施例的各種免疫球蛋白片段-蛋白質綴合物的確W濃度 依賴性方式與化Rn結合。結果同樣顯示在下表1中，利用等式2計算出的綴合物的解離度顯 示在下表2中。 巧146] 表1:在P冊.0下免疫球蛋白片段-蛋白質綴合物對化化的結合親和力的比較
[0147]
[0148] *ka:締合速率常數，kd:解離速率常數，Kd :親和力常數，結合比率:通過將在抑7.4 下結合的量除W在PH6.0下結合的量并將相除值乘W100而得到的值。 巧149] 表2:免疫球蛋白片段-蛋白質綴合物與化化解離度的比較
[0150]
[0151] 如在上表1和2中可W看到的，在酸性pH或中性pH下的結合親和力在免疫球蛋白片 段單獨（沒有與其連接的治療性蛋白的獨立Fc)和本發明的綴合物之間無顯著差別。換言 之，發現，在根據本發明生成的免疫球蛋白-蛋白質綴合物的情況下，即使在免疫球蛋白的 確結合至生理活性蛋白時免疫球蛋白片段對化化的結合親和力也沒有改變，并且具體地， 含有大小不同的各種生理活性蛋白質的綴合物顯示出相似的結果。然而，比較實施例的框 內化P-1R激動劑-免疫球蛋白Fc片段綴合物顯示出高結合比率，因此在中性pH下并不與 化化適當地解離，運表明相比于本發明的綴合物，其對延長生理活性蛋白半衰期的作用較 小。 巧152] 實驗實施例2:在化P-1R激動劑-免疫球蛋白化片段綴合物之間的體內藥物代謝動 力學的比較測試
[0153]為比較實施例（5)的化P-1R激動劑-免疫球蛋白化片段綴合物和框內化P-1R激動 劑-免疫球蛋白化片段綴合物之間的體內藥物代謝動力學，使用正常SD大鼠分析綴合物血 清濃度中的變化。
[0154] 具體地，在生理鹽水中對GLP-1R激動劑-免疫球蛋白化片段綴合物(400mcg/kg)和 框內化P-1R激動劑-免疫球蛋白Fc片段綴合物(400mcg/kg)的每一種進行稀釋，并W2mL/kg 的劑量皮下施用給動物。在施用測試物質后4、8、24、48、72、96、120、144、168、192、216、240、 288、312和336小時，從大鼠的頸靜脈中收集血液，并從血液中分離出血清。接下來，通過酶 聯免疫吸附試驗對血清樣品中的每一個的藥物濃度進行定量，定量結果顯示在圖4中。
[0155] 結果，GLP-1R激動劑-免疫球蛋白Fc片段綴合物和框內化P-1R激動劑-免疫球蛋白 Fc片段綴合物的血清半衰期分別為40.9小時和28小時，并且綴合物的最大血清濃度分別為 1758.6ng/mL和742.7ng/mL。換言之，當W相同劑量將藥物皮下施用給正常大鼠時，顯示相 比于框內化P-1R激動劑-免疫球蛋白Fc片段綴合物，本發明的化P-1R激動劑-免疫球蛋白片 段綴合物在體內吸收和半衰期方面是優異的（圖4)。
[0156] 盡管已經參考具體的說明性實施方式描述了本發明，但本發明所屬領域的技術人 員理解，本發明可其它具體的形式體現而不背離本發明的技術精神或本質特征。因此， 上述實施方式被認為是對各個方面的說明而非限制。此外，本發明的范圍是由所附權利要 求而不是詳細描述限定，并且應理解，源自本發明含義和范圍的所有修改或變化及其等價 物都包含在所附權利要求的范圍內。
【主權項】
1. 生理活性多膚-免疫球蛋白Fe片段綴合物，其包括通過非膚基連接體與包含化化-結 合區域的免疫球蛋白化片段連接的生理活性多膚，其中在抑6.0下與化Rn結合的綴合物的 量和在pH7.4下與化化結合的綴合物的量的結合比率在通過在用于所述綴合物的相同條件 下測量與Fe化結合的所述免疫球蛋白Fe片段的量而測定的比率的±6%范圍內。2. 權利要求1所述的綴合物，其中所述生理活性多膚-免疫球蛋白Fe片段綴合物的結合 比率，如使用下列等式所測定的，在所述免疫球蛋白Fe片段的結合比率的±6%范圍內： 等式1 結合比率（％ )=(在pH7.4下結合的量/在P冊.0下結合的量）X 100。3. 權利要求1或2所述的綴合物，其中所述綴合物是通過在抑4.0-9.0下使具有與其連 接的所述非膚基連接體的所述生理活性多膚與所述免疫球蛋白Fe片段反應，從而通過所述 非膚基連接體將所述生理活性多膚與所述免疫球蛋白化片段的除化化-結合區外的部分連 接而獲得。4. 權利要求1或2所述的綴合物，其中所述非膚基連接體選自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二 醇-丙二醇共聚物、聚氧乙締化多元醇、聚乙締醇、多糖、葡聚糖、聚乙締基乙酸、可生物降解 聚合物、脂質聚合物、幾下質、透明質酸及其組合。5. 權利要求1或2所述的綴合物，其中所述非膚基連接體是由下列式1表示的聚乙二醇 聚合物：式1 其中n的范圍從10至2400。6. 權利要求1或2所述的綴合物，其中所述非膚基連接體具有選自醒基、丙醒基、下醒 基、馬來酷亞胺基和班巧酷亞胺衍生物的反應性基團，。7. 權利要求1或2所述的綴合物，其中所述生理活性多膚選自膜高血糖素樣膚-UGLP- 1)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、人生長激素化GH)、紅細胞生成素化PO)、膜高血糖素、泌 酸調節膚、膜島素、生長激素釋放激素、生長激素釋放膚、干擾素、干擾素受體、G蛋白偶聯受 體、白細胞介素、白細胞介素受體、酶、白細胞介素結合蛋白、細胞因子結合蛋白、巨隧細胞 活化因子、巨隧細胞膚、B細胞因子、T細胞因子、蛋白A、變態反應抑制劑、細胞壞死糖蛋白、 免疫毒素、淋己毒素、腫瘤壞死因子、腫瘤阻抑劑、轉移生長因子、曰-1-抗膜蛋白酶、白蛋白、 曰-乳清蛋白、脫脂載脂蛋白-E、高度糖基化紅細胞生成素、血管生成素、血紅蛋白、凝血酶、 凝血酶受體激活膚、凝血調節蛋白、血液因子￥11、￥11曰、￥111、^和乂111、纖溶酶原激活因 子、纖維蛋白結合膚、尿激酶、鏈激酶、賠素、蛋白質C、C-反應蛋白、腎素抑制劑、膠原酶抑制 劑、超氧化物歧化酶、瘦蛋白、血小板衍生生長因子、上皮生長因子、表皮生長因子、制管張 素、血管緊張素、骨生長因子、骨刺激蛋白、降巧素、屯、鋼素、軟骨誘導因子、依降巧素、結締 組織活化因子、組織因子通道抑制劑、促濾泡激素、黃體生成素、黃體生成素釋放激素、神經 生長因子、甲狀旁腺激素、松弛素、促膜液素、生長調節素、膜島素樣生長因子、腎上腺皮質 激素、縮膽囊素、膜多膚、胃泌素釋放膚、促腎上腺皮質激素釋放因子、促甲狀腺激素、自毒 素、乳鐵蛋白、肌生成抑制蛋白、細胞表面抗原、病毒衍生的疫苗抗原、單克隆抗體、多克隆 抗體、W及抗體片段。8. 權利要求1或2所述的綴合物，其中包含所述FcRn-結合區的所述免疫球蛋白Fc片段 包括C肥結構域、C冊結構域或二者。9. 權利要求1或2所述的綴合物，其中所述免疫球蛋白Fc片段是非糖基化的形式。10. 權利要求1或2所述的綴合物，其中所述免疫球蛋白Fc片段進一步包括較鏈區。11. 權利要求1或2所述的綴合物，其中所述免疫球蛋白化片段選自IgG、IgA、IgD、IgE、 IgM、其組合、和其雜合。12. 權利要求1或2所述的綴合物，其中所述免疫球蛋白Fc片段是IgG4Fc片段。13. 制備維持免疫球蛋白Fc片段對化Rn的內在結合親和力的生理活性多膚-免疫球蛋 白Fc片段綴合物的方法，所述方法包括： (a) 通過非膚基連接體將生理活性多膚與包含FcRn-結合區域的免疫球蛋白化片段連 接，W制備生理活性多膚-免疫球蛋白Fc片段綴合物的混合物;和 (b) 從所述混合物中分離生理活性多膚-免疫球蛋白化片段綴合物，所述綴合物，如通 過將在抑6.0下與化化結合的量和在抑7.4下與化化結合的量代入下列等式1所測定的，顯 示在所述免疫球蛋白Fc片段結合比率的± 6 %范圍內的結合比率： 等式1 結合比率（％) =(在pH7.4下結合的量/在P冊.0下結合的量）X 100。14. 權利要求13所述的方法，其中所述非膚基連接體是由下列式1表示的聚乙二醇聚合 物：式1 其中n的范圍從10至2400。15. 權利要求13所述的方法，其中在步驟(b)中分離的所述綴合物具有非膚基連接體與 所述免疫球蛋白化片段的N-末端結合的結構。16. 維持生理活性多膚-免疫球蛋白化片段綴合物對化化的內在結合親和力的方法，所 述方法包括通過非膚基連接體將生理活性多膚與包含化化-結合區域的免疫球蛋白Fc片段 連接。17. 權利要求16所述的方法，其中在體內實施對內在結合親和力的維持。18. 組合物，其包括權利要求1所述的生理活性多膚-免疫球蛋白化片段綴合物，所述組 合物維持所述免疫球蛋白Fc片段對FcRn的內在結合親和力。
【專利摘要】本發明涉及生理活性多肽-免疫球蛋白Fc片段綴合物，其包含通過非肽基連接體與具有FcRn-結合區域的免疫球蛋白Fc片段連接的生理活性多肽并且維持免疫球蛋白Fc片段的內在結合親和力；制備該綴合物的方法；維持該綴合物對FcRn內在結合親和力的方法；以及包含該綴合物的組合物，其維持免疫球蛋白Fc片段對FcRn的內在結合親和力。
【IPC分類】C07K19/00, C07K16/46
【公開號】CN105593243
【申請號】CN201480049342
【發明人】黃祥淵, 李鐘守, 洪性熙, 崔仁榮, 鄭圣燁, 權世昌
【申請人】韓美藥品株式會社
【公開日】2016年5月18日
【申請日】2014年7月14日
【公告號】CA2917838A1, EP3020732A1, US20160152684, WO2015005747A1