維持FcRn結合強度的免疫球蛋白Fc綴合物的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及生理活性多膚-免疫球蛋白化片段綴合物，所述綴合物包括通過非膚 基連接體與具有化Rn-結合區域的免疫球蛋白Fc片段連接的生理活性多膚，并且能夠維持 免疫球蛋白化片段內在結合親和力；制備該綴合物的方法、維持該綴合物對化化的內在結 合親和力的方法；W及包括該綴合物的組合物，所述組合物能夠維持免疫球蛋白化片段對 Fc化的內在結合親和力。
【背景技術】
[0002] 已經對包含與蛋白質連接W增加蛋白質血清半衰期的載體一一如聚乙二醇聚合 物、白蛋白、脂肪酸或抗體化(恒定區)一一的蛋白質綴合物或復合物進行了各種研究。迄今 為止已知有關此類蛋白質綴合物或復合物的研究主要目的是增加藥物的血清半衰期W縮 短給藥間隔，從而提高患者方便性。然而，許多常規技術存在問題，如由于例如由治療性蛋 白和載體蛋白之間的非特異性結合引起的空間位阻而使治療性蛋白的活性降低。此外，在 可逆結合至血清白蛋白W增加其血清半衰期的脂肪酸綴合物的情況下，因為由于蛋白質和 脂肪酸之間的可逆結合而無法避免腎臟清除一一導致蛋白質藥物的最大損失，顯著提高蛋 白質藥物的血清半衰期是有限的。
[0003] 而且，已經做出努力W利用免疫球蛋白片段增加包括蛋白質的生物活性物質的半 衰期。免疫球蛋白化的CH2-C冊區域包括延長抗體半衰期的化化(保護性受體)-結合位點。 化Rn是在血管內皮細胞中表達的MHC I類相關蛋白質，并且與IgG和白蛋白結合。典型地， IgG和化化在弱酸性抑下彼此緊密結合并且在中性抑下彼此解離。因此，當IgG通過胞飲作 用或內吞作用從血管進入血管內皮細胞并進入溶酶體(PH6.0)時，其受到化化保護而不被 降解。當IgG通過再循環與細胞膜融合時，其在pH7.4下與化化解離并且被釋放到血管中。因 為該過程，包括化化-結合位點的IgGl、IgG2和IgG4的體內半衰期平均為3周，比其它蛋白質 的體內半衰期長。
[0004] 因此，當免疫球蛋白化片段與生物活性物質連接時，可W通過Fc化-介導的再循環 增加生物活性物質的半衰期。對此，有必要開發出能夠在生物活性物質和免疫球蛋白化片 段連接在一起時維持免疫球蛋白化片段對化化結合親和力而不降低生物活性物質活性的 方法。
【發明內容】
[000引技術問題
[0006]本發明人已作出大量努力來開發運樣的綴合物，其能夠維持免疫球蛋白Fc片段自 身對化Rn的內在結合親和力而不降低生理活性多膚的活性，并且能夠在中性pH下容易與 化化解離。結果，本發明人發現，包括通過非膚基連接體與具有化化-結合區域的免疫球蛋 白Fc片段連接的生理活性多膚的綴合物能夠維持免疫球蛋白化片段對Fc化的內在結合親 和力，同時，能夠在7.4的中性抑下容易與Fc化解離，從而完成本發明。
[0007] 技術方案
[0008] 本發明的一個目的是提供包含通過非膚基連接體與包括Fc化-結合區域的免疫球 蛋白化片段連接的生理活性多膚的生理活性多膚-免疫球蛋白化片段綴合物，其中在P冊.0 下與化化結合的綴合物的量和在pH7.4下與化化結合的綴合物的量的結合比率在通過在用 于該綴合物的相同條件下測量免疫球蛋白Fc片段與FcRn結合的量而測定的比率的±6%范 圍內。
[0009] 本發明的另一個目的是提供包含通過非膚基連接體與包括化化-結合區域的免疫 球蛋白化片段連接的生理活性多膚的生理活性多膚-免疫球蛋白Fc片段綴合物，其中通過 將在抑6.0下與化化結合的綴合物的量和在抑7.4下與化化結合的綴合物的量代入下列等 式1而測定的結合比率在通過在用于該綴合物的相同條件下測量與FcRn結合的免疫球蛋白 化片段的量而測定的結合比率的±6%范圍內： 巧010] 等式1
[001。 結合比率（％ )=(；在抑7.4下結合的量/在抑6.0下結合的量）X100。
[0012] 本發明的又一個目的是提供用于制備維持免疫球蛋白化片段對化化的內在結合 親和力的生理活性多膚-免疫球蛋白化片段綴合物的方法，所述方法包括：（a)通過非膚基 連接體將生理活性多膚與具有化化-結合區域的免疫球蛋白化片段連接，W制備生理活性 多膚-免疫球蛋白化片段綴合物的混合物;和(b)從該混合物中分離出生理活性多膚-免疫 球蛋白Fc片段綴合物，所述綴合物，如通過將在pH6.0下與FcRn結合的量和在pH7.4下與 FcRn結合的量代入等式1所測定的，顯示出在免疫球蛋白Fc片段結合比率的±6 %范圍內的 結合比率。
[0013] 本發明的又一個目的是提供維持生理活性多膚-免疫球蛋白化片段綴合物對化化 內在結合親和力的方法，所述方法包括通過非膚基連接體將生理活性多膚與包含化Rn-結 合區域的免疫球蛋白Fc片段連接。
[0014] 本發明的又一個目的是提供包含生理活性多膚-免疫球蛋白Fc片段綴合物的組合 物，其維持免疫球蛋白Fc片段對Fc化的內在結合親和力。
[001引有利效果
[0016] 如上所述，本發明的綴合物維持免疫球蛋白化片段對FcRn的內在結合親和力，同 時，在中性抑(如pH 7.4)下容易與Fc化解離。因此，其能夠有利地用于增加生理活性多膚的 血清半衰期。
[0017] 附圖描述
[0018] 圖1是顯示再循環與化化結合的蛋白質的過程的示意圖。
[0019]圖2顯示在酸性pH下免疫球蛋白-蛋白質綴合物與FcRn結合的傳感圖 (sensograms)。
[0020] 圖3顯示在中性抑下免疫球蛋白-蛋白質綴合物與化化結合的傳感圖。
[0021] 圖4顯示對化P-1R激動劑-免疫球蛋白片段綴合物的體內藥物代謝動力學進行比 較的測試結果。
【具體實施方式】
[0022] 為實現上述目的，一方面，本發明提供了包括通過非膚基連接體與包含化化-結合 區域的免疫球蛋白Fc片段連接的生理活性多膚的生理活性多膚-免疫球蛋白化片段綴合 物，其中在pH6.0下與FcRn結合的綴合物的量和在pH7.4下與FcRn結合的綴合物的量的結合 比率在通過在用于該綴合物的相同條件下測量免疫球蛋白Fc片段與FcRn結合的量而測定 的比率的±6%范圍內。
[0023] 在一個實施方式中，根據本發明的綴合物，如使用下列等式所測定的，顯示出在免 疫球蛋白Fc片段結合比率的± 6 %范圍內的結合比率：
[0024] 等式 1
[002引結合比率（％ )=(在抑7.4下結合的量/在抑6.0下結合的量）X 100。
[0026] 在另一個實施方式中，可W在抑4.0-9.0下通過使具有與其連接的非膚基連接體 的生理活性多膚與免疫球蛋白Fc片段反應，從而通過非膚基連接體將生理活性多膚與免疫 球蛋白Fc片段的除Fc化-結合區域外的部分連接而得到根據本發明的綴合物。
[0027] 在又一個實施方式中，包含在根據本發明的綴合物中的非膚基連接體可選自聚乙 二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙締化多元醇、聚乙締醇、多糖、葡聚糖、聚乙 締基乙酸、可生物降解聚合物、脂質聚合物、幾下質、透明質酸及其組合。
[0028] 在又一個實施方式中，包含在根據本發明的綴合物中的非膚基連接體可W是由下 列式1表示的聚乙二醇聚合物：
[0029] 式1
[0030]
[0031 ] 其中η的范圍從10至2400。
[0032] 在又一個實施方式中，包含在根據本發明的綴合物中的非膚基連接體可具有選自 醒基、丙醒基、下醒基、馬來酷亞胺基W及班巧酷亞胺衍生物的反應性基團。
[0033] 在又一個實施方式中，包含在根據本發明的綴合物中的生理活性多膚可選自膜高 血糖素樣膚-1 (GLP-1)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、人生長激素化GH)、紅細胞生成素 化Ρ0)、膜高血糖素、泌酸調節膚、膜島素、生長激素釋放激素、生長激素釋放膚、干擾素、干 擾素受體、G蛋白偶聯受體、白細胞介素、白細胞介素受體、酶、白細胞介素結合蛋白、細胞因 子結合蛋白、巨隧細胞活化因子、巨隧細胞膚、Β細胞因子、Τ細胞因子、蛋白Α、變態反應抑制 劑、細胞壞死糖蛋白、免疫毒素、淋己毒素、腫瘤壞死因子、腫瘤阻抑劑、轉移生長因子、曰-1 抗膜蛋白酶、白蛋白、曰-乳清蛋白、脫脂載脂蛋白-Ε、高度糖基化紅細胞生成素、血管生成 素、血紅蛋白、凝血酶、凝血酶受體活化膚、凝血調節蛋白、血液因子￥11、￥11曰、￥111、1乂和 XIII、纖溶酶原活化因子、纖維蛋白結合膚、尿激酶、鏈激酶、賠素、蛋白質C、C-反應蛋白、腎 素抑制劑、膠原酶抑制劑、超氧化物歧化酶、瘦蛋白、血小板衍生生長因子、上皮生長因子、 表皮生長因子、制管張素、血管緊張素、骨生長因子、骨刺激蛋白、降巧素、屯、鋼素、軟骨誘導 因子、依降巧素、結締組織活化因子、組織因子通道抑制劑、促濾泡激素、黃體生成素、黃體 生成素釋放激素、神經生長因子、甲狀旁腺激素、松弛素、促膜液素、生長調節素、膜島素樣 生長因子、腎上腺皮質激素、縮膽囊素、膜多膚、胃泌素釋放膚、促腎上腺皮質激素釋放因 子、促甲狀腺激素、自毒素(autotaxin)、乳鐵蛋白、肌生成抑制蛋白（myos化tin)、細胞表面 抗原、病毒衍生的疫苗抗原、單克隆抗體、多克隆抗體W及抗體片段。
[0034] 在又一個實施方式中，包含在根據本發明的綴合物中的包含FcRn-結合區域的免 疫球蛋白Fc片段可包括C肥結構域、C冊結構域、或二者。
[0035] 在又一個實施方式中，包含在根據本發明的綴合物中的免疫球蛋白化片段可W是 W非糖基化的形式。
[0036] 在又一個實施方式中，包含在根據本發明的綴合物中的免疫球蛋白化片段可包括 較鏈區。
[0037] 在又一個實施方式中，包含在根據本發明的綴合物中的免疫球蛋白化片段可選自 IgG、IgA、I曲、I巧、IgM、其組合及其雜合化ybrids)。
[0038] 在又一個實施方式中，包含在根據本發明的綴合物中的免疫球蛋白化片段可W是 IgG4Fc 片段。
[0039] 另一方面，本發明提供了制備維持免疫球蛋白Fc片段對Fc化的內在結合親和力的 生理活性多膚-免疫球蛋白Fc片段綴合物的方法，該方法包括：（a)通過非膚基連接體將生 理活性多膚與包含化Rn-結合區域的免疫球蛋白化片段連接而制備生理活性多膚-免疫球 蛋白化片段綴合物的混合物;和(b)從該混合物中分離出生理活性多膚-免疫球蛋白Fc片段 綴合物，所述綴合物，如通過將在抑6.0下與化化結合的量和在pH7.4下與化化結合的量代 入等式1所測定的，顯示出在免疫球蛋白Fc片段結合比率的±6%范圍內的結合比率。
[0040] 在一個實施方式中，用于根據本發明的制備方法的非膚基連接體可W是