由下式1 表示的聚乙二醇聚合物：
[0041] 式 1
[0042]
[0043] 其中η的范圍從10至2400。
[0044] 在又一個實施方式中，在根據本發明的制備方法的步驟(b)中分離的綴合物可具 有非膚基連接體與免疫球蛋白Fc片段N-末端結合的結構。
[004引又一方面，本發明提供了維持生理活性多膚-免疫球蛋白化片段綴合物對FcRn的 內在結合親和力的方法，該方法包括通過非膚基連接體將生理活性多膚與包含化化-結合 區域的免疫球蛋白Fc片段連接。
[0046] 在一個實施方式中，可W在體內實施對內在結合親和力的維持。
[0047] 又一方面，本發明提供了包括生理活性多膚-免疫球蛋白化片段綴合物的組合物， 其維持免疫球蛋白Fc片段對FcRn的內在結合親和力。
[0048] 發明方式
[0049] 一方面，本發明提供了包括通過非膚基連接體與包含化Rn-結合區域的免疫球蛋 白Fc片段連接的生理活性多膚的生理活性多膚-免疫球蛋白化片段綴合物，其中在抑6.0下 與Fc化結合的綴合物的量和在pH7.4下與Fc化結合的綴合物的量的比率在通過在用于該綴 合物的相同條件下測量與FcRn結合的免疫球蛋白Fc片段的量而測定的比率的±6%范圍 內。
[0050] 如本文使用的，表述"生理活性多膚-免疫球蛋白化片段綴合物的結合量"是指在 所關注的抑下與FcRn結合的綴合物蛋白質的濃度相對于與FcRn結合或未結合的綴合物蛋 白質的總濃度的比率。在本發明中，由于該結合量用于計算在兩個抑下結合的量之間的比 率，因此結合量之間的比率可由在一個pH下測得的絕對結合量計算出，并且還可通過測量 與所結合的綴合物的量成比例且容易測量的其它物理量來測定。例如，可W通過測量表面 等離子共振(SPR)信號并計算抑6.0和pH7.4下信號之間的比率來測定結合量之間的比率。 此外，其它方法也可用于測定結合量之間的比率。
[0051]具體地，本發明提供了包括通過非膚基連接體與包含化Rn-結合區域的免疫球蛋 白Fc片段連接的生理活性多膚的生理活性多膚-免疫球蛋白化片段綴合物，其中通過將在 P冊.0下與化化結合的綴合物的量和在pH7.4下與Fc化結合的綴合物的量代入下列等式1而 測定的結合比率小于通過在用于該綴合物的相同條件下測量與FcRn結合的免疫球蛋白Fc 片段的量而測定的結合比率的±6%范圍： 巧052] 等式1
[0053] 結合比率（％ )=(在pH7.4下結合的量/在P冊.0下結合的量）X 100。
[0054] 結合比率可W通過將在抑7.4下與Fc化結合的綴合物(或免疫球蛋白化片段）的量 除W在抑6.0下與FcRn結合的綴合物(或免疫球蛋白Fc片段）的量并將該相除值乘W100而 作為百分比（％)值得到。
[0055] 可W利用由Weirong Wang等人（D抓G METABOLISM AND DISPOSITION 39:1469- 1477,2011)提出的用于預測單克隆抗體半衰期的方法計算結合比率，但并不具體限于此。 在上述文獻描述的方法中，具有高結合比率的單克隆抗體顯示出短的體內半衰期。
[0056] 可具體利用表面等離子共振法進行測量結合比率的方法，但并不具體限于此。
[0057] 例如，可通過下述步驟進行測量結合比率的方法:使用胺偶聯試劑盒等將化Rn固 定在生物傳感器忍片(例如，Biacore CM5生物傳感器忍片)上，向Fc化固定化生物傳感器忍 片注射含有待測量與化化結合程度的物質（如，綴合物或免疫球蛋白化片段)的酸性緩沖液 (如，pH6.0緩沖液），然后將中性緩沖液(例如，pH7.4緩沖液勝入到生物傳感器忍片中。運 種情況下，可W通過在將PH6.0緩沖液中的樣品注入忍片完成之前測量平衡狀態下的共振 單位(RU) W確定pH6.0下結合的量，在注射pH7.4緩沖液之后測量共振單位W確定pH7.4下 結合的量，然后將pH7.4下結合的量除WpH6.0下結合的量來測定結合比率。要W百分比表 示結合比率時，則可W將相除值乘W100。
[0058] 上述方法中，PH6.0緩沖液的組成不受具體限制，只要其可W引起待測量與化化結 合程度的物質和化化之間的結合。例如，PH6.0緩沖液可W是含鹽（如憐酸鹽）的緩沖液。緩 沖液中的鹽濃度可W是50-200mM，但并不限于此。另外，可W在約25°C溫度下將緩沖液注入 到Fc化固定化生物傳感器忍片中，但測量溫度可在緩沖液pH不變化的溫度范圍內變化。
[0059] 此外，pH6.0緩沖液可含有待測量與化化結合程度的物質。pH6.0緩沖液中待測量 與FcRn結合程度的物質的濃度不受具體限制，只要可W測得與FcRn的結合程度。例如， P冊.0緩沖液中待測量與Fc化結合程度的物質的濃度可W在lOOnM和12.5nM之間。
[0060] 上述方法中，pH7.4緩沖液的組成不受具體限制，只要其可W引起待測量與化化結 合程度的物質和化化之間的解離。例如，pH7.4緩沖液可W是含憐酸鹽的緩沖液。緩沖液中 的鹽濃度可^是50-20011^，但并不限于此。另外，可^在25~37°(：溫度下將抑7.4緩沖液注 入到化化固定化生物傳感器忍片中，但并不限于此。在【具體實施方式】中，在25°C溫度下測量 結合量之間的比率。
[0061] 而且，在pH6.0下FcRn和待測量與化Rn結合程度的物質之間的結合量可w是在將 P冊.0樣品注射完成之前的2-60秒測量的共振單位值。FcRn和待測量與化化結合程度的物 質之間的結合優選在測量時間點處于平衡狀態。
[0062] 另外，在PH7.4下FcRn和待測量與化Rn結合程度的物質之間的結合量可W是在將 pH7.4緩沖液注射之后的10-20秒測量的共振單位值。測量時間點優選在RU值快速變化的時 間點和在RU值達到0之前之間。
[0063] 在免疫球蛋白化片段和根據本發明的綴合物之間的結合比率的對比中，結合比率 優選在相同實驗條件下通過相同實驗方法測定的值，但緩沖液的組成和溫度可根據綴合物 的類型而變化。
[0064] 上述表面等離子共振方法是用于測定結合比率的方法中的一種。除表面等離子共 振方法之外，任何方法都可用于本發明，只要其是可W測量與化化結合的綴合物的量的方 法，如酶聯免疫吸附測定法化LISA)。此外，結合量的單位可根據所用方法而變化。
[0065] 當包括通過非膚基連接體連接至具有化化-結合區域的免疫球蛋白化片段的生理 活性多膚的生理活性多膚-免疫球蛋白化片段綴合物的結合比率，如通過上述方法所測定 的，在免疫球蛋白化片段自身結合比率的± 6.0 %范圍內時，生理活性多膚-免疫球蛋白化 片段綴合物具有長的體內半衰期。
[0066] 本發明中發現，即使當生理活性多膚通過非膚基連接體與具有化Rn-結合區域的 免疫球蛋白Fc片段共價連接形成綴合物時，也可W維持免疫球蛋白化片段對Fc化的內在結 合親和力，運表明免疫球蛋白化片段的細胞內再循環能夠容易發生，W增加體內半衰期。具 體地，當非膚基連接體與免疫球蛋白化片段的除Fc化-結合區外的部分結合時，其不降低免 疫球蛋白化片段對化化的結合親和力。當非膚基連接體為聚乙二醇(-[0-C出-C出]η-)時，- [0-C出-C出]η-中的η為10或更大，具體地10-2400，更具體地10-480，并且甚至更具體地50- 250,但并不限于此。
[0067] 發現，當-[0-C此-C出]η-中的η具體為10-2400 W及更具體為50-2400時，聚乙二醇 并不影響生理活性多膚和免疫球蛋白化片段中每一個的生理活性和化化-結合活性。本發 明正是基于該特性。
[0068] 如本文使用的，術語"生理活性多膚-免疫球蛋白化片段綴合物"是指運樣的綴合 物，其包括通過非膚基連接體與具有化化-結合區域的免疫球蛋白化片段共價連接的生理 活性多膚，并且如通過將抑6.0下與化化結合的量和ρΗ7.4下與化化結合的量代入等式1所 測定的，顯示出在免疫球蛋白化片段結合比率的±6.0%范圍內的結合比率。
[0069] 可將綴合物中的非膚基連接體連接至遠離免疫球蛋白Fc片段的化化-結合區域的 氨基酸殘基，例如，對應于根據Kabat編號系統編號的CH2的位置252-257和307-311W及C肥 的位置433-436的區域。非膚基連接體可優選連接至免疫球蛋白Fc片段的N-末端或C-末端， 更優選連接至N-末端，但并不限于此。
[0070] 當非膚基連接體與免疫球蛋白Fc片段的N-末端或C-末端連接時，其基本上不降低 免疫球蛋白Fc片段對化化的結合親和力，因而可W維持綴合物的免疫球蛋白化片段對Fc化 的內在結合親和力。
[0071] 如本文使用的，術語"非膚基連接體"是指由彼此相連的兩個或更多個重復單元構 成的生物相容性聚合物，其中重復單元通過任意非膚共價鍵彼此相連。該非膚基連接體可 具有兩個或Ξ個末端。
[0072] 本發明中使用的非膚基連接體可選自可生物降解聚合物，如聚乙二醇、聚丙二醇、 乙二醇與丙二醇的共聚物、聚氧乙締化多元醇、聚乙締醇、多糖、葡聚糖、聚乙締基乙酸，可 生物降解聚合物，如聚乳酸(PLA)和聚乳酸-徑基乙酸(PLGA)、脂質聚合物、幾下質、透明質 酸及其組合，但并不限于此。優選地，非膚基連接體為聚乙二醇，例如，由下列式1表示的聚 乙二醇聚合物，但不限于：
[0073] 式 1
[0074]
[00巧]其中η的范圍從10至2400,優選從10至480,更優選從50至250,但并不限于此。
[0076] 同時，其它具有對應于式1的聚乙二醇的分子量的非膚基連接體也落在本發明的 范圍內。
[0077] 此外，本領域已知的它們的衍生物從及可從在現有技術中容易制備得到的非膚基 連接體衍生物也落在本發明的范圍內。
[0078] 用作本發明中的非膚基連接體的聚乙二醇的優點在于，它并不導致結合至其兩端 的生理活性多膚和免疫球蛋白Fc片段之間的空間位阻，因此可W維持生理活性多膚的生理 活性和免疫球蛋白Fc片段對Fc化的結合親和力兩者。
[0079] 用于由常規框內（in-frame)融合法制得的融合蛋白的膚基連接體的缺點在于:其 容易在體內被蛋白酶裂解，因而不能獲得通過載體增加活性藥物血清半衰期的預期效果。 然而，包含根據本發明的非膚基連接體的綴合物明顯地克服了該缺點。非膚基連接體可W 是對蛋白酶具有抗性W維持膚的血清半衰期的聚合物，與載體相似。因此，任何非膚基連接 體都可不受任何限制地用于本發明，只要其是具有上述功能的聚合物，即，在體內對蛋白酶 具有抗性的聚合物。
[0080] 此外，與本發明中的免疫球蛋白化片段連接的非膚基連接體不僅可W由一種聚合 物