長度上總共650至850個(gè)(如700-800個(gè))氨基酸殘 基。
[0072] 在某些實(shí)施方式中，F(xiàn)CA蛋白包含和SEQ ID NO: 1、2或3的氨基酸序列具有至少 80 % (如至少85 %、90 %、95 %或95 % )序列同一性的氨基酸序列。
[0073] 在一些實(shí)施方式中，本文所述FCA蛋白中的RRM1結(jié)構(gòu)域選自由SEQ ID N0:7、10和 13構(gòu)成的組。
[0074] 在一些實(shí)施方式中，本文所述FCA蛋白中的RRM2結(jié)構(gòu)域選自由SEQ ID N0:8、ll和 14構(gòu)成的組。
[0075] 在一些實(shí)施方式中，本文所述FCA蛋白中的WW結(jié)構(gòu)域選自由SEQ ID N0:9、12和15 構(gòu)成的組。
[0076] 在具體的實(shí)施方案中，F(xiàn)CA蛋白包含選自由SEQ ID NO: 1、2和3構(gòu)成的組的氨基酸 序列或者由選自由SEQ ID NO: 1、2和3構(gòu)成的組的氨基酸序列組成。
[OOW]如本文所用，術(shù)語"發(fā)芽"是指包括從植物組織由植物進(jìn)行繁殖。例如，發(fā)芽可能發(fā) 生在種子、塊莖或塊根中。它包括苗的產(chǎn)生，形成葉或芽，或啟動(dòng)運(yùn)些過程而引起葉或芽的 發(fā)育啟動(dòng)。如本文所用，在轉(zhuǎn)基因植物中發(fā)芽的抑制是指運(yùn)種發(fā)育過程中的抑制、延遲或延 緩，例如與對(duì)照或野生型植物相比，更低或更慢的發(fā)芽率或更小或更矮的苗。在一些實(shí)施方 式中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物表現(xiàn)出種子中的發(fā)芽率是相同的條件下野生型植物常規(guī)發(fā)芽率 的約90%、80%、70%、60%、50%或更少。
[0078] 本發(fā)明方法可W應(yīng)用的植物包括單子葉植物。單子葉植物的實(shí)例包括但不限于水 稻、大麥、小麥、黑麥、燕麥、玉米、竹子、甘薦、洋蔥、韭菜和姜。在本發(fā)明一個(gè)具體的實(shí)施方 式中，轉(zhuǎn)基因植物是轉(zhuǎn)基因谷類植物，優(yōu)選轉(zhuǎn)基因水稻植物。
[0079] 根據(jù)本發(fā)明，轉(zhuǎn)化有導(dǎo)致FCA蛋白過度表達(dá)的FCA基因的轉(zhuǎn)基因植物令人驚奇地顯 示出抑制植物種子發(fā)芽，使得可W降低早期發(fā)芽所致的經(jīng)濟(jì)損失。
[0080] 在一些實(shí)施方式中，植物組織是繁殖材料，選自種子。
[0081] 在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法還包括從所述轉(zhuǎn)基因植物中收集植物種子。
[0082] 在一些實(shí)施方式中，在從轉(zhuǎn)基因植物中收獲植物組織之前發(fā)生發(fā)芽的抑制。
[0083] 在一些實(shí)施方式中，在從轉(zhuǎn)基因植物中收獲植物組織之后發(fā)生發(fā)芽的抑制。
[0084] 在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，相較于對(duì)照植物（例如非轉(zhuǎn)基因植物）的種子而言，本 發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生具有更低或更慢萌發(fā)率的種子、或者萌發(fā)之后產(chǎn)生更小的苗或更矮 的芽的種子;然后選擇運(yùn)樣的轉(zhuǎn)基因植物，并任選進(jìn)一步回收種子。
[0085] 通過下面的實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，提供實(shí)施例用于說明性的目的而非限制的 目的。根據(jù)本公開的內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，在所公開的【具體實(shí)施方式】中可W進(jìn)行許 多變化并仍然獲得相似或類似的結(jié)果，而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。
[0086] 實(shí)施例
[0087] 我們的研究主要集中在谷物FCA的功能。在此文章中，我們分析了FCA在復(fù)雜的ΑΒΑ 信號(hào)傳導(dǎo)途徑上的功能W及對(duì)種子萌發(fā)和收獲前發(fā)芽的調(diào)節(jié)。
[0088] 不同于AtFCA對(duì)開花時(shí)間調(diào)節(jié)的原有功能，在轉(zhuǎn)基因水稻中發(fā)現(xiàn)改變OsFCA的表達(dá) 不影響開花時(shí)間控制。OsFCA的過度表達(dá)增強(qiáng)，而它的RNAi抑制，ΑΒΑ上調(diào)的LEA蛋白合成的。 然而，OsFCA不影響充分表征的GA誘導(dǎo)的α-淀粉酶合成和ΑΒΑ抑制的運(yùn)一過程。FCA-GFP融合 蛋白最初W點(diǎn)狀(punctate)模式定位于細(xì)胞質(zhì)，但隨后逐漸易位到核。OsFCA的運(yùn)種從胞漿 到核的易位被ΑΒΑ處理進(jìn)一步增強(qiáng)。然而，ΑΒΑ作用的主要抑制因子abil(蛋白憐酸酶2C的一 種顯性突變)抑制OsFCA的運(yùn)種胞漿/核易位。在植物中，雙雜交研究表明OsFCA與VP1相互作 用，但不與ABI5直接相互作用。體外pull-down分析還證實(shí)，VP1和FCA彼此相互作用。OsFCA 中高度保守的WW結(jié)構(gòu)域的突變抑制核易位，擾亂FCA-VP1相互作用，也抑制ΑΒΑ信號(hào)傳導(dǎo)。我 們的結(jié)果表明，谷物FCA通過將ΑΒΑ信號(hào)由胞漿轉(zhuǎn)導(dǎo)至核而在ΑΒΑ信號(hào)傳導(dǎo)中起著舉足輕重 的作用，在核中該蛋白與ΑΒΑ上調(diào)基因表達(dá)所必需的VP1/ABI5轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物相互作用。水 稻FCA還在收獲前的發(fā)芽調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用，并且可W應(yīng)用在其它谷類作物的收獲前發(fā)芽控 制中。
[0089] 1.材料和方法
[0090] 1.1植物材料
[0091]水稻(OiTza sativa)栽培品種臺(tái)農(nóng)(Tainung)67被用于運(yùn)項(xiàng)研究。水稻的苗在28 °C生長于Kimura B營養(yǎng)液中，1化/8D光周期。在所有的瞬時(shí)分析中使用大麥種子化ordeum vulgare L. CV.Himalaya)。按照(Gomez-hdenas等人2001)所描述的制備半個(gè)的無胚種子。 [0092] 1.2質(zhì)粒構(gòu)建
[009引由國立農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所(NIAS)的水稻基因組資源中屯、(RGRC)提供水稻FCA cDNA 克隆(GenBank登錄號(hào)AK073225和AK058419)。通過PCR從FCA cDNA克隆擴(kuò)增水稻FCA的編碼 區(qū)。通過RT-PCR從大麥種子的總RNA中擴(kuò)增大麥FCA的編碼區(qū)域。對(duì)于FCA的低表達(dá)，擴(kuò)增水 稻FCA 0RF的核巧酸編號(hào)307-822和大麥FCA 0RF的核巧酸編號(hào)1532-1945。所有的PCR產(chǎn)物 被T/A克隆到pCRS/GW/TOPO載體中（Invitrogen)。通過測序證實(shí)序列W及在載體中的插入 方向。在運(yùn)項(xiàng)研究中，針對(duì)所有瞬時(shí)實(shí)驗(yàn)和植物的轉(zhuǎn)化，將GatewayS-compa1 ibic載體 (Invitrogen，卡爾斯魯厄，德國）用于產(chǎn)生質(zhì)粒構(gòu)建物。通過LR重組，使用LR克隆酶 (Invitrogen)按照制造商的說明將PCR8/GW/T0P0載體中的插入DNA片段進(jìn)一步亞克隆到目 的載體中。對(duì)于植物轉(zhuǎn)化，目的載體是pANDA(Miki和Shimamoto,2004)和pBI-化i-GW，對(duì)于 瞬時(shí)表達(dá)分析是pANDA-mini(Miki和aiimamoto,2004)和pUC-Ubi-GW。對(duì)于瞬時(shí)分析，報(bào)告 構(gòu)建體ABRC3-GUS和Amy32b-GUSW及效應(yīng)構(gòu)建體35S-ZmVPl和加 i-HvABI5已有描述 (McCarty等人 1991 ;Lan址an等人 1992; Armstrong等人 1995; hsaretto和Ho ,2003)。組成型 構(gòu)建體PAHC18化bi 1-LUC)(化en等人1993)用作內(nèi)部對(duì)照。
[0094] 1.3植物轉(zhuǎn)化
[0095] 質(zhì)粒 pBI-師 i-〇sFCA 和pBI-Ubi-OsFCA-RNAi 被引入根瘤農(nóng)桿菌（Agrobacterium t皿ef ac i ens)株LBA4404，按照(化en等人2002)所述進(jìn)行水稻轉(zhuǎn)化。
[0096] 1.4萌發(fā)測試
[0097] 水稻種子去殼并通過25 %市售漂白劑加0.1 %吐溫-20滅菌30分鐘，隨后用無菌水 洗涂6次。在有或沒有ΑΒΑ的情況下，將滅菌的種子置于含有8-lOml水的9cm平皿中。于28°C 在黑暗中解育平皿。隨著種子萌發(fā)對(duì)帶有2-3mm下胚軸的種子每天進(jìn)行評(píng)分，對(duì)于過度表達(dá) 的品系至長達(dá)7天，而對(duì)于RNAi品系則長達(dá)10天。在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中，每平皿采用30個(gè)種子并且 每個(gè)品系Ξ個(gè)平皿。種子萌發(fā)重復(fù)Ξ次。
[009引1.5收獲前的發(fā)芽(P服)評(píng)價(jià)
[0099] 按照(Groos等人2002)的描述評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因水稻的收獲前發(fā)芽(PHS)。抽穗后40至42 天，切除野生型和轉(zhuǎn)基因水稻的完整穗，通過25%市售漂白劑表面滅菌30分鐘，并通過大量 的無菌水洗涂6次，然后在試管中在去離子水中浸泡4小時(shí)。除去額外的水，并在管的底部保 留約1cm的水W保持濕潤。在28°C解育7至11天后，針對(duì)每個(gè)穗記錄發(fā)芽的和未發(fā)芽谷粒的 數(shù)目。
[0100] 2.結(jié)果
[0101 ] 2.1在轉(zhuǎn)基因水稻糊粉細(xì)胞和大麥糊粉細(xì)胞中FCA-過度表達(dá)增強(qiáng)而FCA-RNAi抑制 ΑΒΑ誘導(dǎo)的基因表達(dá)
[0102]為了測試FCA對(duì)于誘導(dǎo)ΑΒΑ響應(yīng)基因是否重要，我們使用來自FCA過度表達(dá)品系和 FCA-RNAi品系的種子作為材料用于表達(dá)分析。在野生型中，ABRCl-GUS報(bào)告基因在水稻糊粉 細(xì)胞中通過ΑΒΑ處理得W高度誘導(dǎo)。在FCA過度表達(dá)的轉(zhuǎn)基因品系中，ΑΒΑ響應(yīng)性報(bào)告基因表 達(dá)的ΑΒΑ誘導(dǎo)水平比野生型中的水平高約30% (圖1Α)。與此相反，在FCA-RNAi的轉(zhuǎn)基因品系 中誘導(dǎo)水平被抑制（圖1B)。運(yùn)些轉(zhuǎn)基因植物的研究表明，F(xiàn)CA在ΑΒΑ信號(hào)傳導(dǎo)中是重要的。為 進(jìn)一步研究FCA功能，在大麥糊粉細(xì)胞中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)分析。效應(yīng)化i-FCA或化i-FCA-RNAi 與報(bào)告構(gòu)建體共同轟擊到大麥的糊粉細(xì)胞中。和水稻糊粉細(xì)胞類似，ABRCl-GUS報(bào)告基因在 大麥糊粉細(xì)胞中通過ΑΒΑ處理得W高度誘導(dǎo)。FCA的過度表達(dá)將ΑΒΑ響應(yīng)性誘導(dǎo)增強(qiáng)了約 25% (圖2Β)，而FCA的RNAi抑制降低了誘導(dǎo)（圖2D)。然而，另兩個(gè)信號(hào)途徑，即α-淀粉酶基因 表達(dá)的GA誘導(dǎo)和ΑΒΑ抑制，則根本不會(huì)受到FCA過度表達(dá)或RNAi的影響（圖2C和圖2Ε)。運(yùn)些 表明FCA只能在ΑΒΑ信號(hào)傳導(dǎo)中作為增強(qiáng)子發(fā)揮作用。
[0103] 2.2在大麥糊粉細(xì)胞中FCA-過度表達(dá)增強(qiáng)而FCA-RNAi抑制VPl/ABI5誘導(dǎo)的基因表 達(dá)
[0104] 在植物種子中，bZIP轉(zhuǎn)錄因子ΑΒΙ5和VP1對(duì)于ΑΒΑ響應(yīng)性基因表達(dá)發(fā)揮重要的作 用。ΑΒΙ5和VP1在大麥糊粉細(xì)胞中的共表達(dá)足W誘導(dǎo)ΑΒΑ響應(yīng)性LEA基因的表達(dá)。為了研究 FCA是否也增強(qiáng)ABI5/VP1的誘導(dǎo)能力，我們?cè)诖篼満奂?xì)胞中共表達(dá)運(yùn)些基因，并觀察它們 的效果。無需ΑΒΑ處理，ABI5和VP1的共表達(dá)誘導(dǎo)ΑΒΑ響應(yīng)報(bào)告基因的表達(dá)（圖3) dFCA的過度 表達(dá)將ABI5/VP1誘導(dǎo)能力增強(qiáng)了約30% (圖3B)，而FCA的RNAi抑制降低了運(yùn)種誘導(dǎo)（圖3C)。 運(yùn)表明在基因轉(zhuǎn)錄過程中FCA可W直接對(duì)AB15/VP1發(fā)揮作用。
[010引 2.3在水稻種子萌發(fā)當(dāng)中FCA的過度表達(dá)導(dǎo)致ΑΒΑ過度敏感，而FCA-RNAi導(dǎo)致ΑΒΑ敏 感性過低
[0106] 為了闡明OsFCA在水稻中的生物功能，產(chǎn)生了帶有OsFCA-過度表達(dá)和FCA-RNAi構(gòu) 建體的轉(zhuǎn)基因水稻。純合種子進(jìn)行種