抑制植物組織發芽的方法
【專利說明】
[0001] 相關申請
[0002] 根據351].5.(：.§119(6)，本申請要求2014年8月18日提交的1].5.臨時專利申請 No. 62/038，621的優先權，通過引用將其內容全部并入本文。
技術領域
[0003] 本申請設及一種抑制植物種子發芽(sprouting)的方法。更具體而言，本發明設及 一種通過向植物引入編碼FCA蛋白的多核巧酸來抑制發芽種子的方法，尤其是收獲前的發 芽。
【背景技術】
[0004] ΑΒΑ介導內部的信號傳導途徑，不僅能適應非生物性的脅迫，也能調節植物的發 育。已經表明，一些ΑΒΑ不敏感的突變體也顯示出早期開花(early flowering)的表型，運表 明了 ΑΒΑ在調節開花中的作用(Takai等人，2001)。
[000引FCA已被鑒定為是一種核RNA結合蛋白，其通過抑制化C(一種開花的負調節因子） 而促進開花化e等人2003;Henderson和06311，2004)。擬南芥。〔4包含色氨酸-色氨酸(醫)結 構域和兩個RNA識別基序(RRM) dFCA需要通過它的WW結構域和另一調節因子FY相互作用，用 來調節開花時間（Simpson等人2003)。認為FCA RRM調節單個低拷貝基因的染色質沉默 (Baurle 等人2007)。
[0006] 在擬南芥中，FCA參與ΑΒΑ介導的開花時間和側根生長的調節。FCA曾經被認為是 ΑΒΑ受體(Razem等人2006,2008)。盡管ΑΒΑ結合活性受到嚴重的質疑，FCA的確調節一些ΑΒΑ 介導的響應。然而，尚不清楚FCA作為ΑΒΑ調節因子是如何工作的機制。
[0007] 最近，PYR/P化/RCAR家族的蛋白已被鑒定為ΑΒΑ受體(Ma等人，2009)。在擬南芥中， 運些蛋白質的ΑΒΑ傳感是通過它們與一些PP2C(包括ABI1)直接的相互作用而進行的。運種 相互作用抑制運些PP2C的憐酸酶活性，并導致亞類III SnRK2的激活（Nishimura等人， 2009)。一些轉錄因子調節ΑΒΑ信號傳導，并且可W被Sn服2激活。ABI5(-種基礎結構域/亮 氨酸拉鏈(b-ZIP)轉錄因子(TF))識別并結合許多ΑΒΑ誘導的啟動子區域的ABRE(也稱為 ACGT-盒），從而導致基因激活(化saretto和化，2003)。擬南芥aM5突變體在ΑΒΑ響應方面有 困難，比如在種子萌發期間對ΑΒΑ的敏感性降低，W及許多ΑΒΑ所調節的基因（包括LEA基因） 的表達被改變(Gampala等人，2002)。
[000引運種ABI5的反式激活過程依賴于另一 TF(viviparousl(VPl))的存在。ABI5和VP1 的共表達可W模仿含有ABRC的啟動子的ΑΒΑ誘導，但是不影響基因表達的ΑΒΑ抑制 (Casaretto和化，2003) dVPI (-種Β3轉錄因子家族成員）大量表達于種子中。VP1包含4個發 揮不同功能的保守結構域，命名為A1、B1、B2和B3(Suzuki等人，1997)dN端的A1結構域是VP1 的功能結構域(Me化rty等人，1991)dB1結構域負責與ABI5的蛋白-蛋白相互作用(化kamura 等人，2001KB2調節核定位W及B3展現DNA結合活性（Suzuki等人，1997;Marella和 如atrano,2007)。除了調節種子的發育、成熟和萌發，VP1也介導開花和分生組織活性。
[0009]收獲前的發芽(PHS)是種子在收獲之前仍然處于穗中（on the sp化e)時的過早萌 發。由于長時間的降雨和高濕度所致之下，而發生運種萌發，如在南亞、北歐和北美西部地 區的天氣。PHS降低種子的質量，每年造成大量經濟損失。然而，防止谷物PHS的技術非常有 限。
【發明內容】
[0010]在本研究中，出乎意料地發現，調節因子FCA在水稻中的過度表達可顯著降低PHS， 因此降低P服所致的經濟損失。
[0011] 因此，一方面，本發明提供一種抑制植物組織種子的方法，包括：
[0012] (i)向植物細胞中引入編碼FCA蛋白的重組多核巧酸，W獲得轉化的植物細胞； [001引（ii)從所述轉化的植物細胞中產生轉化的植物；從及
[0014] (iii)選擇運樣的轉化的植物，相較于未引入編碼FCA蛋白的重組多核巧酸的非轉 基因植物而言，其產生具有降低的發芽水平的植物種子。
[0015] 另一方面，本發明提供一種轉基因植物，其轉化有編碼FCA蛋白的重組多核巧酸。
[0016] 另一方面，本發明提供植物組織，其來自本文所述的轉基因植物。
[0017] 在一些具體的實施方式中，FCA蛋白包含：
[0018] (a)氨基酸序列，所述氨基酸序列從N端至C端具有第一RNA識別基序(RRM1)、第二 RNA識別基序(RRM2)W及色氨酸-色氨酸(WW)結構域，其中
[0019] (i)所述RRM1，其包含SEQ ID N0:4;
[0020] 。1)所述3觀2，其包含沈9 10備:5;^及 [0021 ] (iii)所述WW結構域，其包含沈Q ID N0:6。
[0022] 在某些實施方式中，FCA蛋白包含長度上總共650至850個(如700-800個)氨基酸殘 基。
[0023] 在某些實施方式中，FCA蛋白包含和SEQ ID NO: 1、2或3的氨基酸序列具有至少 80 % (如至少85 %、90 %、95 %或95 % )序列同一性的氨基酸序列。
[0024] 在某些實施方式中，RRM1選自由SEQ ID N0:7、10和13構成的組;RRM2選自由SEQ ID N0:8、ll和14構成的組;或WW結構域選自由SEQ ID N0:9、12和15構成的組。
[0025] 在一些實施方式中，FCA蛋白包含選自由SEQ ID NO: 1、2和3構成的組的氨基酸序 列或者由選自由SEQ ID NO: 1、2和3構成的組的氨基酸序列組成。
[0026] 在一些實施例中，轉基因植物是單子葉植物，尤其選自水稻、大麥、小麥、黑麥、燕 麥、玉米、竹子、甘薦、洋蔥、韭菜和姜。尤其是，轉基因植物是水稻、大麥或小麥。
[0027] 在一些實施方式中，植物組織是繁殖材料，尤其是種子。
[0028] 在一些實施方式中，本發明的方法在植物種子中有效地抑制了發生在從轉基因植 物中進行收獲之前或收獲之后的發芽。
[0029] 在一些實施方式中，相較于未引入編碼FCA蛋白的重組多核巧酸的非轉基因植物 而言，本發明的轉基因植物產生具有更慢萌發率的種子、或者萌發之后產生更小的苗 (seedling)或更矮的芽(shoot)的種子。
[0030] 一個或更多的本發明實施方式的細節在如下描述中所示。根據如下若干實施方式 的詳細描述W及所附的權利要求，本發明的其它特征或優勢將變得明顯。
【附圖說明】
[0031] 當結合附圖進行閱讀時，將會更好地理解前述的總結、W及本發明的如下詳細描 述。出于闡述本發明的目的，顯示在目前優選的附圖實施方式中。然而，應當理解本發明不 限于所顯示的具體安排和手段。
[0032] 在附圖中：
[0033] 圖1的A-C:在水稻糊粉(aleurone)細胞中，FCA-過度表達增強而FCA-RNAi抑制ΑΒΑ 誘導的基因表達。將報告構建體（圖1A)ABRC1-GUS轟擊到（圖1B)FCA-過度表達W及（圖1C) FCA-RNAi轉基因水稻的半個無胚種子(embryoless half-seed)中。柱(bar)表示轟擊的種 子在含有或不含20μΜ ΑΒΑ的發芽(shooting)緩沖液中解育2地后的GUS活性±SE。
[0034] 圖2的A-E:在大麥糊粉細胞中，FCA改變ΑΒΑ但是不改變GA途徑。（圖2A)瞬時表達分 析中所用的報告和效應構建體的圖。在大麥糊粉細胞中，（圖2B)FCA-過度表達增強而（圖 2D)FCA-RNAi抑制ΑΒΑ誘導的基因表達。（圖2C)(圖2E)GA誘導的基因表達不受影響。在有(+ ) 或者沒有(-)效應構建體Ubi-HvFCA-RNAi或Ubi-HvFCA的情況下，將報告構建體ABRC1-GUS 或Amy3化-GUS轟擊至大麥的半個無胚種子中。柱表示轟擊的半個無胚種子在含有或不含20 μΜ ΑΒΑ或ΙμΜ GA的發芽緩沖液中解育24h后的GUS活性±SE。
[0035] 圖3的A-C:在大麥糊粉細胞中，FCA-RNAi抑制而FCA-過度表達增強VP1/ABI5誘導 的基因表達。（圖3A)瞬時表達分析中所用的報告和效應構建體的圖。在有(+ )或者沒有(-) 效應構建體 Ubi-VPl、Ubi-ABI5W及（圖 3B)Ubi-HvFCA 或(C)Ubi-HvFCA-RNAi 的情況下，將報 告構建體ABRC1-GUS轟擊至大麥的半個無胚種子中。柱表示轟擊的半個無胚種子在發芽緩 沖液中解育2地后的GUS活性± SE。
[0036] 圖4的A-D.種子萌發時，FCA的過度表達導致ΑΒΑ過度敏感，而FCA-RNAi導致ΑΒΑ敏 感性過低化7口〇36113^1乂^7)。。〔4-過度表達（圖44)和（圖4(：處〔4-1?酷1轉基因水稻的種子 萌發時程。在含或不含ΑΒΑ的情況下，在28°C黑暗中將滅菌的水稻種子解育在含8-lOml水的 9-cm平皿中。顯示的數據是Ξ次重復的平均值±56。在每個重復中測量每個轉基因品系的 至少30個種子。在實驗結束時，拍攝生長在含有ΑΒΑ的垂直瓊脂介質上的FCA-過度表達（圖 4Β)和FCA-RNA i (D)的苗的照片。
[0037] 圖5的A-C.FCA的過度表達抑制收獲前的發芽，但是不改變抽穗日期。（圖5A)抽穗 之后40至42天切除的穗（于25°C解育在潮濕容器（chamber)中。在第11天拍攝照片。（圖5B) 在第7、9和11天，對潮濕的穗上發芽谷粒的數目進行計數。抽穗日期記錄為（圖5C)記錄從萌 發到出現長度約1cm的第一圓錐花序。呈現了獲自兩個生長季節的結果。
[0038] 圖6的A-B.FCA的過度表達抑制收獲前的發芽。（圖6A)抽穗之后37至38天切除的穗 于25°C解育在潮濕容器中。在第11天拍攝照片。（圖6B)在第11天，對潮濕的穗上發芽谷粒的 數目進行計數。
[0039] 圖7. FCA的過度表達抑制收獲前的發芽。切除的成熟穗于25°C解育在