潮濕箱中。在 第3天拍攝照片。
[0040] 圖8.來自水稻、大麥和小麥的FCA的多重序列比對。通過ClustalW進(jìn)行序列比對； 通過BioEdit生成圖。 巧041 ]圖9的A-B.在大麥糊粉細(xì)胞中，F(xiàn)CA-過度表達(dá)增強(qiáng)ΑΒΑ誘導(dǎo)的基因表達(dá)。（圖9A)瞬 時(shí)表達(dá)分析中所用的報(bào)告和效應(yīng)構(gòu)建體的圖。在有(+ )或者沒有(-)效應(yīng)構(gòu)建體Ubi-HvFCA 或化i-OsFCA的情況下，將報(bào)告構(gòu)建體ABRC1-GUS轟擊至大麥的半個無胚種子中。柱表示轟 擊的半個無胚種子在含有(+ )或不含(-)ΙΟμΜ ΑΒΑ的發(fā)芽緩沖液中解育24h后的GUS活性± 沈。
[0042] 圖10的A-C.在大麥糊粉細(xì)胞中，F(xiàn)CA-過度表達(dá)增強(qiáng)VP1/ABI5誘導(dǎo)的基因表達(dá)。（圖 10A)瞬時(shí)表達(dá)分析中所用的報(bào)告和效應(yīng)構(gòu)建體的圖。在有(+ )或者沒有(-)效應(yīng)構(gòu)建體355- VP1、Ub i-AB15和(B) Ub i-OsFCA或(C) Ub i-HvFCA的情況下，將報(bào)告構(gòu)建體 ABRC1-GUS轟擊至 大麥的半個無胚種子中。柱表示轟擊的半個無胚種子在發(fā)芽緩沖液中解育24h后的GUS活性 ±沈。
【具體實(shí)施方式】
[0043] 除非另有指明，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員 所通常理解的相同含義。
[0044] 如本文所使用的，除非上下文另有明確說明，否則單數(shù)形式"一"、"一個"和"該"包 括復(fù)數(shù)指代。因此，例如當(dāng)提及"一個組分"時(shí)包括多個運(yùn)樣的組分W及本領(lǐng)域技術(shù)人員已 知的等價(jià)物。
[004引術(shù)語"多核巧酸"或"核酸"是指一種由核巧酸單元組成的聚合物。多核巧酸包括天 然存在的核酸，例如脫氧核糖核酸（"DNA")和核糖核酸（"RNA" )，W及核酸類似物，包括具有 非天然存在的核巧酸的那些。例如，使用自動化DNA合成儀可W合成多核巧酸。術(shù)語"核酸" 通常是指大的多核巧酸。將理解的是，當(dāng)核巧酸序列由DNA序列表示時(shí)（即A、T、G、C)，運(yùn)還包 括RNA序列（即A、U、G、C)，其中"U"代替?'。術(shù)語"cDNA"是指和mRNA互補(bǔ)或相同的DNA，既可 W是單鏈的也可W是雙鏈的形式。
[0046] 術(shù)語"互補(bǔ)"是指兩條多核巧酸相互作用的表面的拓?fù)浼嫒菪曰蚱ヅ湓谝黄稹Ｒ?此，兩個分子可被描述為是互補(bǔ)的，此外接觸的表面特征是彼此互補(bǔ)的。如果第一多核巧酸 的核巧酸序列與第二多核巧酸的多核巧酸結(jié)合伙伴(partner)核巧酸序列相同，則第一多 核巧酸互補(bǔ)于第二多核巧酸。因此，序列是5'-TATAC-3'的多核巧酸互補(bǔ)于序列是5'- GTATA-3'的多核巧酸。
[0047] 術(shù)語"編碼"指的是多核巧酸中特定核巧酸序列（例如，基因、cDNA或mRNA)作為模 板W便在生物過程中合成其它聚合物和大分子的固有屬性，其具有明確的核巧酸序列（即， rRNA、tRNA和mRNA)或明確的氨基酸序列W及由此產(chǎn)生的生物特性。因此，如果轉(zhuǎn)錄并翻譯 由基因所產(chǎn)生的mRNA在細(xì)胞或其它生物系統(tǒng)中產(chǎn)生蛋白，則該基因編碼蛋白。本領(lǐng)域技術(shù) 人員理解，由于遺傳密碼的簡并性，許多不同的多核巧酸和核酸可W編碼相同的多膚。還應(yīng) 當(dāng)理解，技術(shù)人員使用常規(guī)技術(shù)能夠進(jìn)行不影響所述多核巧酸編碼的多膚序列的核巧酸取 代，從而體現(xiàn)任何表達(dá)多膚的特定宿主生物中密碼子的使用情況。因此，除非另外指明，"編 碼氨基酸序列的核巧酸序列"包括所有互為簡并形式的W及編碼相同氨基酸序列的核巧酸 序列。編碼蛋白和RNA的核巧酸序列可W包括內(nèi)含子。
[0048] 術(shù)語"重組多核巧酸"是指運(yùn)樣的多核巧酸或核酸，其具有非天然連接在一起的序 列。重組多核巧酸可W載體的形式存在。"載體"可含有給定的興趣核巧酸序列和調(diào)節(jié)序列。 載體可被用于表達(dá)給定的核巧酸序列(表達(dá)載體)或者保持給定的核巧酸序列W便復(fù)制、操 作或在不同位置(例如，不同生物之間）之間進(jìn)行轉(zhuǎn)移。載體可被引入到用于上述目的的合 適宿主細(xì)胞中。"重組細(xì)胞"是指其中引入有重組核酸的細(xì)胞。
[0049] 如本文所使用的，術(shù)語"可操作地連接"可W指多核巧酸W運(yùn)樣的方式連接至表達(dá) 控制序列，從而當(dāng)合適的分子(如轉(zhuǎn)錄因子)結(jié)合表達(dá)控制序列時(shí)能夠表達(dá)多核巧酸。
[0050] 如本文所用，術(shù)語"表達(dá)控制序列"或"調(diào)節(jié)序列"是指在特定宿主細(xì)胞中對可操作 連接的核酸序列的表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)的DNA序列。
[0051] 載體的實(shí)例包括，但不限于質(zhì)粒、粘粒、隧菌體、YAC或PAC。通常，在載體中，給定的 核巧酸序列被可操作地連接到調(diào)節(jié)序列，使得當(dāng)載體被引入宿主細(xì)胞時(shí)，給定的核巧酸序 列可W在宿主細(xì)胞中在調(diào)節(jié)序列的控制下進(jìn)行表達(dá)。調(diào)節(jié)序列可W包括，例如但不限于啟 動子序列（例如巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子、猿猴病毒40(SV40)早期啟動子、T7啟動子和醇氧 化酶基因（A0X1)啟動子）、起始密碼子、復(fù)制起點(diǎn)、增強(qiáng)子、操縱子序列、分泌信號序列（例 如，-交配因子信號（mating factor si即al)) W及其它控制序列（例如，Shine-Dalgano序 列和終止序列）。優(yōu)選地，載體可進(jìn)一步含有標(biāo)記序列（例如，抗生素抗性標(biāo)記序列）用于隨 后的篩選過程。用于蛋白生產(chǎn)的目的，在載體中，感興趣的給定核巧酸序列可W連接到上述 調(diào)節(jié)序列W外的另一核巧酸序列上，從而產(chǎn)生融合的多膚并有利于隨后的純化過程。所述 融合的多膚包括但不限于化S-標(biāo)簽融合的多膚和GST融合的多膚。
[0052] 當(dāng)為植物細(xì)胞構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)，可W使用本領(lǐng)域中已知的幾種合適的啟動子，包 括但不限于玄參花葉病毒35S啟動子、花挪菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子、鴨巧草黃斑駁病 毒啟動子、水稻胞質(zhì)憐酸丙糖異構(gòu)酶(TPI)啟動子、水稻肌動蛋白l(Actl)基因啟動子、泛素 化bi)啟動子、水稻淀粉酶基因啟動子、擬南芥的腺嚷嶺憐酸核糖轉(zhuǎn)移酶(APRT)啟動子、甘 露堿合酶和章魚堿合酶的啟動子。
[0053] 為了制備轉(zhuǎn)基因植物，優(yōu)選本文所使用的表達(dá)載體帶有一個或更多選擇標(biāo)記用于 選擇轉(zhuǎn)化的植物，例如賦予對抗生素(如潮霉素、氨節(jié)青霉素、慶大霉素、氯霉素、鏈霉素、卡 那霉素、新霉素、遺傳霉素及四環(huán)素)抗性的基因、URA3基因、賦予對任何其它有毒化合物 (如某些金屬離子或除草劑，如草錠麟或雙丙氨麟)抗性的基因。
[0054] 如本文所用，術(shù)語"轉(zhuǎn)基因植物"或"轉(zhuǎn)基因品系"是指包含編碼基因（即轉(zhuǎn)基因）的 重組核巧酸序列的植物。轉(zhuǎn)基因植物可W從重組細(xì)胞中生長。
[0055] 本領(lǐng)域中可獲得多種可用于工程改造穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因植物的程序。在本發(fā)明的一個實(shí) 施方式中，轉(zhuǎn)基因植物是通過用重組水稻細(xì)胞轉(zhuǎn)化植物組織(如原生質(zhì)體或植物葉盤)并從 轉(zhuǎn)化的植物組織中產(chǎn)生整株植物而產(chǎn)生的，其中所述重組水稻細(xì)胞包含編碼所需蛋白（例 如FCA蛋白）的多核巧酸。在另一個實(shí)施方式中，特別是如果在植物中用重組植物細(xì)胞進(jìn)行 轉(zhuǎn)化無效時(shí)，可W通過基因槍技術(shù)將編碼所需蛋白的多核巧酸引入植物。
[0056] 術(shù)語"多膚"或蛋白是指由通過膚鍵連接的氨基酸殘基組成的聚合物。
[0057] 如本文所使用的，術(shù)語"過度表達(dá)"可W指轉(zhuǎn)基因植物中基因產(chǎn)物的生產(chǎn)超過非轉(zhuǎn) 基因植物中生產(chǎn)的水平，包括但不限于組成型或誘導(dǎo)的表達(dá)。
[0058] 本發(fā)明提供了一種通過用編碼FCA蛋白的重組多核巧酸轉(zhuǎn)化植物W便過度表達(dá) FCA蛋白而抑制植物種子發(fā)芽，尤其是收獲前的發(fā)芽的方法。本發(fā)明還提供如此轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基 因植物和由此獲得的植物組織。相較于未引入編碼FCA蛋白的重組多核巧酸的非轉(zhuǎn)基因植 物而言，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物表現(xiàn)出植物種子中降低水平的發(fā)芽。本發(fā)明有效地抑制或延 緩植物種子中的發(fā)芽，特別是收獲前的發(fā)芽，并且也用于延長植物種子的膽存期，如收獲 后。
[0059] 具體而言，本發(fā)明的用于抑制植物種子發(fā)芽的方法包括：
[0060] (i)向植物細(xì)胞中引入編碼FCA蛋白的重組多核巧酸，W獲得轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，
[0061] (ii)從所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞中產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的植物；W及
[0062] (iii)選擇運(yùn)樣的轉(zhuǎn)化的植物，相較于未引入編碼FCA蛋白的重組多核巧酸的非轉(zhuǎn) 基因植物而言，其產(chǎn)生具有降低的發(fā)芽水平的植物種子。
[0063] 如本文所使用的，F(xiàn)CA蛋白被稱為有利于開花的核RNA結(jié)合蛋白，其具有WW結(jié)構(gòu)域 W及一個或兩個RRM。在某些實(shí)施方式中，如本文所使用FCA蛋白源自水稻、大麥或小麥，具 有SEQ ID N0:l、2或3的氨基酸序列。
[0064] 可W理解的，多膚可具有在多膚特定部分內(nèi)可進(jìn)行的有限數(shù)目的改變或修飾，其 中所述的改變或修飾和它們活性或功能無關(guān)，并仍然產(chǎn)生具有可接受水平的等價(jià)生物活性 或功能的分子。在運(yùn)種多膚的結(jié)構(gòu)中可W進(jìn)行修飾和改變，并仍然獲得具有相似或所需特 征的分子。例如，在膚/多膚結(jié)構(gòu)（除了保守的區(qū)域）中某些氨基酸可W被取代成其它氨基 酸，而不明顯損失活性。氨基酸的取代通?；诎被醾?cè)鏈取代基的相對相似性，例如它們 的疏水性、親水性、電荷、大小等。例如，精氨酸(Arg)、賴氨酸化ys)、和組氨酸化is)都是帶 正電荷的殘基;丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)和絲氨酸(Ser)都具有類似的大小。因此，基于運(yùn) 些考慮，精氨酸(Arg)、賴氨酸化ys)和組氨酸化is); W及丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)和絲氨 酸(Ser)可W被定義為生物學(xué)功能等價(jià)物。人們能夠很容易地設(shè)計(jì)和制備重組基因，用于具 有等價(jià)氨基酸殘基的多膚的微生物表達(dá)。
[006引為了確定兩個氨基酸序列的百分比同一性，出于最佳比較的目的進(jìn)行序列比對 (例如，在第一氨基酸序列的序列中引入缺口 W便和第二氨基酸序列最佳比對）。在計(jì)算百 分比同一性時(shí)，通常是對精確的匹配進(jìn)行計(jì)數(shù)。可W使用本領(lǐng)域中已知的數(shù)學(xué)算法確定兩 個序列之間的百分比同源性或同一性，如化AST和Gapped BLAST程序、NBLAST和XBLAST程 序、或ALIGN程序。
[0066] 在具體的實(shí)施方式中，本文所述的FCA蛋白包含：
[0067] (a)氨基酸序列，所述氨基酸序列從N端至C端具有第一RNA識別基序(RRM1)、第二 RNA識別基序(RRM2)W及色氨酸-色氨酸(WW)結(jié)構(gòu)域，其中
[006引 （i)所述RRM1，其包含沈Q ID N0:4;
[0069] 。1)所述3觀2，其包含沈9 10備:5;^及
[0070] (iii)所述WW結(jié)構(gòu)域，其包含沈Q ID N0:6。
[0071] 在某些實(shí)施方式中，F(xiàn)CA蛋白包含