>[0102] HPPD-F：5-ATGGCTGATATCTTCGACAACCCG-3
[0103] HPPD-R：5-TTATTCGACGTTCAGGACGCCGC-3
[0104] 以菌株MTCC5279為模板，克隆HPPD基因。
[0105] PCR反應體系如下：
[0108] 補無菌雙蒸水至50yL。
[0109] PCR反應程序：
[0111] 取5yL PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將剩余PCR產物送測序;測序結 果為如SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列。
[0112] S42、HPH)基因表達載體的構建
[0113] 測序確定該基因為HPPD基因后，使用PCR產物純化試劑盒(Omega)回收PCR產物，再 使用不同限制性內切酶(Pacl和Sbfl)酶切純化的PCR產物，形成粘性末端;酶切的片段和經 過同樣酶切處理過的細菌表達載體PADV3進行連接，16°C過夜。構建得到表達載體pADV3-MT79HPPD。
[0114]引物設計如下：
[0115] MT79-F：
[0116] 5-ACGAAAAACCTTAATTAAATGGCTGATATCTTCGACAACCCG-3 Pacl
[0117] MT79-R：
[0118] 5-ACTAAAAAAACCTGCAGGTTATTCGACGTTCAGGACGCCGC-3 Sbfl
[0119] 劃線處為酶切位點Pacl和Sbfl，前面的序列為保護堿基序列。以菌株MTCC5279為 模板，克隆HPro基因。
[0120] PCR反應體系如下：
[0122] 補無菌雙蒸水至50yL。
[0123] PCR反應程序：
[0125] 酶切體系如下：
[0127] 加雙蒸水至100μΙ。
[0128] 連接體系如下：
[0130] 16°C連接過夜。
[0131] 實施例5
[0132] 本實施例為克隆到的HPro基因的抗性測試步驟。
[0133] 將細菌表達載體pADV3-MT79HPPD用熱激法轉入大腸桿菌Transl-Tl感受態細胞， PCR及其酶切驗證轉化結果后做抗性測試。由于pADV3載體可以在大腸桿菌Transl-Tl細胞 中表達，因此，將檢測陽性PADV3-MT79HPH)轉化的Transl-Tl大腸桿菌細胞直接做抗性測試 即可。
[0134] 首先，將單克隆細胞在液體LB培養基中活化過夜；
[0135] 其次，將活化的菌轉接入了10、了11、了15、了110以及了120抗性測試培養基中，以 pADV3-pfHPro轉化的Transl-Tl大腸桿菌為陽性對照，以空載pADV3質粒轉化的Transl-Tl 大腸桿菌為陰性對照，于37°C，300r/min搖床中培養并觀察顏色的變化。
[0136] 根據所述抗性篩選培養基顏色的深淺程度對其HPro抑制劑抗性進行打分評級，若 培養基的顏色變為深色，則表示HPPD基因能在加了除草劑的培養基中生長，即該HPPD基因 抗該除草劑，顏色越深，則表示HPH)抑制劑抗性越強。若測定的培養基的顏色無變化，而陽 性對照的培養基變為深色，則表示該基因不抗測定的除草劑，該實施例的培養基顏色變化 結果如圖1所不。
[0137] 盡管已用具體實施例來說明和描述了本發明，然而應意識到，在不背離本發明的 精神和范圍的情況下可以作出許多其它的更改和修改。因此，這意味著在所附權利要求中 包括屬于本發明范圍內的所有這些變化和修改。
【主權項】
1. 一種篩選抗HPPD抑制劑類除草劑基因的方法，其特征在于，包括如下步驟： 1) 、將含有HPPD抑制劑類除草劑抗性微生物的多種微生物在含有HPPD抑制劑的抗性篩 選培養基中培養，得到抗性菌種，并對其純化培養獲得單克隆； 2) 、以所述單克隆的基因組為模板擴增該單克隆的HPPD基因的開放閱讀框序列，將擴 增產物連入質粒中并于細菌中進行原核表達，得到重組菌株； 3 )、對重組菌株的HPPD抑制劑抗性進行驗證，獲得抗HPPD抑制劑類除草劑基因。2. 如權利要求1所述的篩選抗HPPD抑制劑類除草劑基因的方法，其特征在于，在步驟1) 中，所述培養的具體過程為： 將微生物樣本于含有HPPD抑制劑的抗性篩選培養基中培養1~10次，且培養次數大于1 次時，在每相鄰兩次培養所用抗性篩選培養基中，后一次培養的HPPD抑制劑濃度均不低于 前一次，且后一次培養的菌種來源于前一次培養中存活下來的微生物菌種。3. 如權利要求2所述的篩選抗HPPD抑制劑類除草劑基因的方法，其特征在于，在步驟3) 中，抗性驗證具體包括： 以步驟1)中篩選到的抗性菌種的HPPD抑制劑濃度為最高濃度設置HPPD抑制劑濃度梯 度，將步驟3)中所述重組菌株于HPPD抑制劑含量梯度設置的抗性篩選培養基中培養，以篩 選抗HPH)抑制劑類除草劑基因。4. 如權利要求1~3任一項所述的篩選抗HPPD抑制劑類除草劑基因的方法，其特征在 于，所述HPH)抑制劑為硝磺草酮或環磺酮。5. 如權利要求4所述的篩選抗HPPD抑制劑類除草劑基因的方法，其特征在于： 在步驟1)中，HPPD抑制劑含量的范圍為1~20mM硝磺草酮或0.25~5mM環磺酮，相鄰濃 度梯度設置的間距為1.5~5倍。6. 如權利要求1所述的篩選抗HPH)抑制劑類除草劑基因的方法，其特征在于，所述抗性 篩選培養基為含有1~20mM硝磺草酮或0.25~5mM環磺酮的SMNT基本培養基； 按體積份數計，所述SMNT基本培養基包括以下組份： 5XM9 鹽溶液 190~210份、245 ~255mM的MgS〇4溶液4.5~5.0份、97~103111]\1的〇3(：12溶液 0.8~1.2份、0.128%酪氨酸溶液778~784份、水9~11份； 所述5XM9鹽溶液中包括：Na2HP〇4.7H2〇 60~68g/L、KH2P〇4 14~16g/L、NaCl 2.4~ 2.6g/L、NH4Cl 4.8~5.2g/L; 所述5 XM9鹽溶液、MgS〇4溶液、CaCl2溶液及0.128%酪氨酸溶液所用溶劑均為水。7. 如權利要求1所述的篩選抗HPPD抑制劑類除草劑基因的方法，其特征在于，在步驟2) 中： 當所述單克隆種屬未知時，則擴增所述單克隆的部分16s rRNA序列，并將擴增產物測 序以確定所述單克隆種屬； 根據得到的種屬信息查詢所述單克隆的HPPD基因序列并以此為模板設計引物擴增得 到具有HPro抑制劑抗性的HPro基因片段并測序； 根據測序結果設計引物，將所述具有HPro抑制劑抗性的HPro基因的開放閱讀框序列連 入質粒中并于細菌中進行原核表達。8. 如權利要求7所述的篩選抗HPPD抑制劑類除草劑基因的方法，其特征在于，在步驟2) 中： 所述質粒為pADV3; 所述pADV3的序列由原核表達載體pUC57改造而來，其改造方法為:將pUC57中的MCS序 列替換為SEQ ID NO: 1所示序列。9. 權利要求1~8任一項所述篩選方法獲得的抗HPPD抑制劑類除草劑基因在培育抗 HPH)抑制劑類除草劑植物品種中的應用。10. 權利要求1~8任一項所述篩選方法獲得的抗HPPD抑制劑類除草劑基因，其序列為 SEQIDN0:3**。
【專利摘要】本發明涉及基因工程領域，具體而言，涉及一種篩選抗HPPD抑制劑類除草劑基因的方法，該方法以含有HPPD抑制劑的培養基對微生物進行高通量篩選，經16s？rRNA測序法對篩選到的微生物進行鑒定，通過鑒定結果確定其種屬，進而克隆到HPPD基因并進行驗證。本發明提供的方法可在短時間內篩選、分離和分析抗HPPD抑制劑基因，不用對分離的個別菌株篩選，較傳統方法目標性強，操作簡便，節約了大量的人力和物力。
【IPC分類】A01H5/00, C12N15/10, C12N15/31, C12N15/82
【公開號】CN105524931
【申請號】CN201610070377
【發明人】余宗蘭, 鄧龍群, 胥南飛
【申請人】四川天豫興禾生物科技有限公司
【公開日】2016年4月27日
【申請日】2016年1月29日