s rRNA的引物如：
[0035] https: //en · wikipedia · org/wiki/16S_ribosomal_RNA中所述；
[0036] 本申請優選了上游引物為27F，下游引物為1492R。
[0037] 由于微生物基因組的多樣性，網上查到的序列可能與實際不一致，所以對有些菌 株需要先在查到的基因序列上下游較遠的地方設計引物將HPro基因序列完整的克隆出來， 再測序驗證，進而獲得正確的HPro基因序列的開放閱讀框序列。
[0038] 優選的，如上所述的篩選抗HPH)抑制劑類除草劑基因的方法，在步驟2)中：
[0039] 所述質粒為PADV3;
[0040]所述PADV3的序列由原核表達載體pUC57改造而來，其改造方法為：將pUC57中的 MCS序列替換為SEQ ID N0:1所示序列。
[0041 ] 改造后的PADV3與PUC57相比，只有MCS(Multiple Cloning Site，多克隆位點）序 列部分不一樣。原核表達載體PADV3中啟動子和終止子的增加，可以幫助抗HPH)抑制劑在大 腸桿菌中更好的表達。
[0042] pADV3可與大腸桿菌Transl-Tl搭配使用。
[0043] Transl-Tl感受態細胞是目前生長速度最快的感受態細胞，在氨芐青霉素平板上， 8~9h可見克隆；用于藍、白斑篩選，12h可見藍斑;將過夜培養的單克隆在2ml的LB培養基中 培養4~5h即可進行小量質粒提取;適用于高效的DNA克隆和質粒擴增，減少克隆DNA同源重 組的發生，提高質粒DNA的產量和質量;具有T1，T5噬菌體抗性。使用pUC19質粒檢測，轉化效 率可達 109cfu/yg。
[0044] 根據如上所述的篩選抗HPPD抑制劑類除草劑基因的方法獲得的抗HPPD抑制劑類 除草劑基因在培育抗HPro抑制劑類除草劑植物品種中的應用。
[0045] 根據如上所述的所述篩選方法獲得的抗HPH)抑制劑類除草劑基因，其序列為SEQ ID N0:3所示
[0046] 與現有技術相比，本發明的有益效果為：
[0047] 1)、本發明提供的方法可在短時間內篩選、分離和分析抗HPro抑制劑基因，不用對 分離的個別菌株篩選，較傳統方法目標性強，操作簡便，節約了大量的人力和物力。
[0048] 2)、本發明提供的方法可從抗性微生物含量極低的稀有樣品中篩選、分離出抗 HPro抑制劑的微生物及其基因。
[0049] 3)、通過本申請提供的方法，可分離獲得不同濃度抗性的菌株，具有很廣闊的應用 前景。
【附圖說明】
[0050] 圖1為實施例5中以pADV3-pfHPro轉化的Transl-Tl大腸桿菌在培養基中的顏色變 化結果。
【具體實施方式】
[0051] 下面將結合實施例對本發明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會 理解，下列實施例僅用于說明本發明，而不應視為限制本發明的范圍。實施例中未注明具體 條件者，按照常規條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為 可以通過市售購買獲得的常規產品。
[0052] 實施例1
[0053] 一種篩選抗HPH)抑制劑類除草劑基因的方法，包括如下步驟：
[0054] S11、將含有HPPD抑制劑類除草劑抗性微生物的多種微生物在含有HPPD抑制劑的 抗性篩選培養基中培養，得到抗性菌種，并對其純化培養獲得單克隆；
[0055] S12、以所述單克隆的基因組為模板擴增該單克隆的HPro基因的開放閱讀框序列， 將擴增產物連入質粒中并于細菌中進行原核表達，得到重組菌株；
[0056] S13、對重組菌株的HPH)抑制劑抗性進行驗證，獲得抗HPH)抑制劑類除草劑基因。
[0057] 需要說明的是，若待測樣本中含有HPPD抑制劑類除草劑抗性微生物，則用本方法 即可篩選獲得其抗HPPD抑制劑基因。HPro抑制劑抗性微生物的種屬信息已知或未知均可， 若種屬信息未知，則步驟S12步驟會有所增加，具體參見實施例3~4。
[0058] 實施例2
[0059]本實施例為抗HPH)抑制劑類除草劑菌株的篩選步驟。
[0060] 具體方法如下：
[0061] S21、抗性篩選培養基配置
[0062] 5XM9S(M9鹽）：
[0064] 121°C，滅菌 20min。
[0065] SMNT基本培養基（Salt Medium，Nitrogen and Tyrosine):
[0067] 將以上試劑混合后添加 HPro抑制劑類除草劑即得到抗性篩選培養基。以硝磺草酮 (MeS〇tri〇ne，MT)為例將篩選培養基配制成不同濃度梯度的篩選培養基：
[0068] SMNT-MTl(TMl):在SMNT培養基中加入ImM的硝磺草酮；
[0069] TM5:在SMNT培養基中加入5mM的硝磺草酮。
[0070] S22、抗HPH)抑制劑類除草劑菌株的篩選及抗性測試
[0071] 取0.1-5g樣品加入5ml篩選培養基TM5中，300r/min 30°C培養24-48h;
[0072] 取上清液 1〇〇μ1 接種于5ml的TM5中，300r/min 30°C培養24-48h;
[0073] 待菌長出后取上清液5μ1接種于2ml的TM5中，300r/min 30°C培養24-48h，當菌長 到半飽和及以上時，保存菌。此時得到的菌為抗TM5的菌。
[0074] 分別接種2.5μ1 TM5菌株于lml ΤΜΠΚΤΜ20以及更高的TM培養基中，300r/min 30 °C培養72h后觀察菌的生長情況，若菌長到半飽和及以上，保存菌。綜上，不同濃度抗性的菌 也就分離得到。
[0075] 本領域技術人員可根據實際情況，將本實施例中的硝磺草酮替換為0.25~5mM的 環磺酮或其他濃度范圍的其他HPH)抑制劑。
[0076] 實施例3
[0077]本實施例為分離菌株的鑒定步驟。
[0078]具體方法如下：
[0079] S31、固體LB培養基的配制：
[0082] 121°C，滅菌 20min。
[0083] 將保存的菌株劃線接種于LB固體培養基上，30°C培養24~48h。
[0084] S32、分離菌株的鑒定：
[0085] 使用16s rRNA引物進行鑒定。
[0086] 16s rRNA引物序列如下：
[0087] 16S-27F:5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3;
[0088] 16S-1492R：5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3〇
[0089] PCR反應體系：
[0091 ] 補無菌雙蒸水至50yL。
[0092] PCR反應程序：
[0094] S33、瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增結果，并送樣測序。數據的處理使用NCBI blastn分析分離菌株的同源性，對分離的菌株進行分類整理。測序結果為如SEQ ID N0:2所 示的核苷酸序列。
[0095] 實施例4
[0096] 本實施例為HPH)基因的克隆步驟。
[0097] S41、HPPD基因的克隆
[0098] 根據實施例3中16s rRNA鑒定結果，判斷該微生物為MTCC5279(Pseudomonas putida)。根據在NCBI中找到的該菌株的HPro基因序列設計引物，并以查到的HPro基因為模 版，進行PCR擴增，PCR產物取5yL進行瓊脂糖凝膠電泳后，剩余的PCR產物送測序。
[0099] 由于微生物基因組的多樣性，網上查到的序列可能與實際不一致，所以對有些菌 株需要先在查到的基因序列上下游較遠的地方設計引物將HPH)基因序列完整的克隆出來， 再測序驗證。測序結果為SEQ ID N0:3所示的核苷酸序列。
[0100] 根據測序結果，選取該HPro基因的開放閱讀框(0RF)設計引物，擴增目的基因。
[0101] 引物設計如下：