篩選抗hppd抑制劑類除草劑基因的方法及應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及基因工程領域，具體而言，涉及一種篩選抗HPPD抑制劑類除草劑基因 的方法及應用。
【背景技術】
[0002] 對羥基苯基丙酮酸雙氧化酶（4-Hydroxyphenylpyruvate dioxygenase，ΗΡΡ?)存 在于各種生物體中，它是一種鐵-酪氨酸蛋白，在植物體內可將對羥基丙酮酸（4-Hydroxyphenylpyruvate，ΗΡΡ)催化為尿黑酸（2，5-dihydroxyphenylacetate，HGA)，進而轉 化為光合作用中電子傳遞所需要的重要物質質體醌和生育酚，其中質體醌還是影響八氫番 茄紅素去飽和酶催化的關鍵輔助因子。鑒于其上述重要作用和特點，HPH)成為繼ALS、ACC以 及Protox之后的又一新的除草劑靶標酶。由于該酶抑制劑用于除草方面時具有廣譜、高效、 殘留低、環境相容性好、使用安全的特點，引起人們對其抑制劑研究的重視，該抑制劑的發 現對環境的保護有重大作用，這也是未來除草劑生產發展的趨勢。
[0003] 抗除草劑農作物的種植，更充分地利用了除草劑的優勢。在過去20年里，抗除草劑 作物給農民和環境都帶來了巨大利益。目前生產上種植最多的是抗草甘膦玉米和大豆，從 而使草甘膦的施用非常廣泛。隨著草甘膦的大量使用，抗草甘膦雜草不斷出現，從而影響了 抗草甘膦作物的有效性。因此，開發新型抗除草劑作物，如抗HPPD抑制劑類除草劑作物，勢 在必行。
[0004] 本領域已有一些對抗除草劑HPPD基因的研究，但篩選抗除草劑HPPD基因仍然困 難。用植物直接篩選雖然其結果可直接應用，但植物的生長繁殖周期長，傳代慢，因此篩選 效率非常低，難以用于實踐。抗HPPD抑制劑類除草劑HPPD基因的初步篩選往往是在細菌中 進行。但這些篩選都需要先分離微生物菌株或將HPH)基因克隆在細菌中，再進行單個評估。 這種方法工作量大、范圍廣、沒有針對性，難以進行大規模篩選或從稀有樣品中進行篩選。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于提供一種篩選抗HPro抑制劑類除草劑基因的方法，運用此種方 法篩選抗HPro抑制劑類除草劑基因，不用對分離的個別菌株篩選，較傳統方法目標性強，操 作簡便，可在短時間內篩選得到較多的抗HPro抑制劑類除草劑基因，也容易從稀有樣品中 篩選得到抗HPro抑制劑類除草劑基因。
[0006] 一種篩選抗HPro抑制劑類除草劑基因的方法，包括如下步驟：
[0007] 1 )、將含有HPro抑制劑類除草劑抗性微生物的多種微生物在含有HPro抑制劑的抗 性篩選培養基中培養，得到抗性菌種，并對其純化培養獲得單克隆；
[0008] 2)、以所述單克隆的基因組為模板擴增該單克隆的HPPD基因的開放閱讀框序列， 將擴增產物連入質粒中并于細菌中進行原核表達，得到重組菌株；
[0009] 3)、對重組菌株的HPro抑制劑抗性進行驗證，獲得抗HPro抑制劑類除草劑基因。 [0010] HPFO即對羥基苯基丙酮酸雙氧化酶（4-Hydroxyphenylpyruvate dioxygenase) 〇
[0011] 本發明針對現有的抗HPro抑制劑基因篩選方法中存在的不足，提供了一種快速而 有效地高通量篩選抗HPro抑制劑類除草劑基因的方法，運用此種方法篩選抗HPro抑制劑類 除草劑基因，不用對分離的個別菌株篩選，較傳統方法目標性強，操作簡便，可在短時間內 篩選得到較多的抗HPro抑制劑類除草劑基因。
[0012] 優選的，如上所述的篩選抗HPro抑制劑類除草劑基因的方法，在步驟1)中，所述培 養的具體過程為：
[0013] 將微生物樣本于含有HPPD抑制劑的抗性篩選培養基中培養1~10次，，且培養次數 大于1次時，在每相鄰兩次培養所用抗性篩選培養基中，后一次培養的HPro抑制劑濃度均不 低于前一次，且后一次培養的菌種來源于前一次培養中存活下來的微生物菌種。
[0014] 用此方法可篩選到針對不同濃度HPro抑制劑敏感的菌種，亦即該體系能夠快速篩 選出不同程度的抗HPro抑制劑類除草劑基因。
[0015]進一步優選的，在步驟3)中，抗性驗證具體包括：
[0016]以步驟1)中篩選到的抗性菌種的HPPD抑制劑濃度為最高濃度設置HPPD抑制劑濃 度梯度，將步驟3)中所述重組菌株于HPPD抑制劑含量梯度設置的抗性篩選培養基中培養， 以篩選抗HPH)抑制劑類除草劑基因。
[0017]由于理論上重組菌株的HPro抑制劑抗性不會高于抗性菌種的HPro抑制劑抗性，所 以以抗性菌種的HPro抑制劑濃度為最高濃度。例如篩選到的抗性菌種能夠耐受的最高HPro 抑制劑為10mM硝磺草酮，則在步驟3)中，抗性篩選培養基的HPro抑制劑濃度梯度可設置為 0. lmM、0.5mM、ImM、2mM、5mM、10mM硝磺草酮。在具體的應用中，步驟3)中用到的抗性篩選培 養基可能與步驟1)中略有不同，如在步驟1)中提供的抗性篩選培養基配方的基礎上加上重 組菌株所具有抗性對應的抗生素。
[0018]優選的，如上所述的篩選抗HPPD抑制劑類除草劑基因的方法，所述HPPD抑制劑為 硝磺草酮或環磺酮。
[0019] 硝橫草酮（Mesotrione)又名甲基橫草酮，分子式C14H13NO7S，分子量339 · 32，CAS No: 104206-82-8。它是一類常用的HPH)抑制劑類除草劑的主要成分。
[0020] 環橫酮(Tembotrione)，是由拜耳公司報道的三酮類除草劑，分子式C17H16CIF3O6S， 分子量440.82, CAS No :335104-84-2。
[0021 ]進一步優選的，在步驟1)中：
[0022] HPH)抑制劑含量的范圍為1~20mM硝磺草酮或0.25~5mM環磺酮，相鄰濃度梯度設 置的間距為1.5~5倍。
[0023]相鄰濃度梯度設置的間距為1.5~5倍的含義即后一次培養中培養基的HPPD抑制 劑濃度是前一次培養中培養基的HPro抑制劑濃度的1.5~5倍。
[0024] 優選的，如上所述的篩選抗HPro抑制劑類除草劑基因的方法，所述抗性篩選培養 基為含有1~20mM硝磺草酮或0.25~5mM環磺酮的SMNT基本培養基；
[0025] 按體積份數計，所述SMNT基本培養基包括以下組份：
[0026] 5XM9 鹽溶液200 份、245 ~255mM的MgS〇4溶液4.8份、97~103111]\1的〇3(：12溶液1份、 0.128%酪氨酸溶液778~784份、水9~11份；
[0027] 所述5XM9鹽溶液中包括：Na2HP〇4 · 7H20 60~68g/L、KH2P〇4l4~16g/L、NaCl 2.4 ~2.6g/L、NH4Cl 4.8~5.2g/L;
[0028] 所述5XM9鹽溶液、MgS〇4溶液、CaCl2溶液及0.128%酪氨酸溶液所用溶劑均為水。 [0029]若所篩選的微生物具有HPH)抑制劑抗性，則可在所述抗性篩選培養基中利用酪氨 酸，進而合成質體醌和生育酚從而存活下來。
[0030] 優選的，如上所述的篩選抗HPro抑制劑類除草劑基因的方法，在步驟2)中：
[0031] 當所述單克隆種屬未知時，則擴增所述單克隆的部分16s rRNA序列，并將擴增產 物測序以確定所述單克隆種屬；
[0032]根據得到的種屬信息查詢所述單克隆的HPPD基因序列并以此為模板設計引物擴 增得到具有HPro抑制劑抗性的HPro基因片段并測序；
[0033]根據測序結果設計引物，將所述具有HPro抑制劑抗性的HPro基因的開放閱讀框序 列連入質粒中并于細菌中進行原核表達。
[0034] 16s rRNA普遍存在于所有細菌染色體基因中。rRNA參與生物蛋白質的合成過程， 其功能是任何生物都必不可少的，而且在生物進化的漫長歷程中其基因序列較為保守，變 異較小，可看作為生物演變的時間鐘，其可變區序列因細菌不同而異，恒定區序列基本保 守，所以可利用恒定區序列設計引物，將16s rDNA片段擴增出來，利用可變區序列的差異來 對不同菌屬、菌種的細菌進行分類鑒定。擴增16