一種復合微生態制劑及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于水產微生態制劑技術領域，具體涉及一種微生態制劑及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 近年來，高密度、集約化水產養殖模式極易打破了池塘原有的生態平衡：有害耐藥 細菌及有害藻類大量繁殖；池塘中分解氨氮、亞硝酸鹽及硫化氫等有害物質的微生物不足， 水體中氨氮、亞硝酸鹽等有害物質積累，最終會影響水體中的養殖動物健康和生長品質。因 此，養殖環境中的菌相、藻相平衡以及水中有害物質含量是養殖生產中亟待解決的三大問 題。養殖生產中需要養殖水體中益生菌比例得到提高，氨氮、亞硝酸鹽等有害物質含量降 低，同時，通過促進綠藻、硅藻等有益藻類的生長繁殖，維持藻相平衡，有害藻類過度繁殖得 到抑制。而使用功能全面的微生態制劑能夠達到目的。又因其安全、無污染和無殘留的特 點受到青睞和重視。
[0003]目前，市場上已有眾多的同類產品但還存在許多不足，比如產品中微生物菌株功 能不高效；包含菌株種類多但不乏濫竽充數；菌株環境適應范圍小；產品中菌株間的協作 關系不好，協同效應不好；液體深層發酵技術不穩定，產品一致性差；后處理不當，產品維 持性差等。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的在于提供一種復合微生態制劑。該制劑不僅能夠降低養殖水體中氨 氮和亞硝態氮等有害物質，還能夠促進有益藻的生長，另外，還提供了多種有益微生物以及 分泌有益因子。
[0005] 本發明的另一目的在于提供一種復合微生態制劑的制備方法。
[0006] 本發明提供的復合微生態制劑，其為枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿 菌、地衣芽孢桿菌、屎腸球菌、短小乳桿菌、植物乳桿菌、乳酸乳球菌和釀酒酵母通過混菌液 體深層發酵制備而成。
[0007] 其中，芽孢桿菌的活菌數為1X109tFU/mL，乳酸菌活菌數為1X109 ^CFU/mL，酵 母菌的活菌數為1X1〇6sCFU/mL。
[0008] 其中，所述的枯草芽孢桿菌優選保藏號為CGMCCNo. 9356的枯草芽孢桿菌。
[0009] 其中，所述的屎腸球菌優選保藏號為CGMCCNo. 9134的屎腸球菌。
[0010] 本發明提供的所述的復合微生態制劑的制備方法，包括如下步驟： 1) 種子液制備：分別制備所述菌株的一級和二級種子液； 2) 種子罐發酵：將步驟1)的制備的所述菌株的種子液混合均勻后接入種子罐進行 混合發酵，發酵溫度33°C，轉速60-100rpm，灌壓0.5Mpa，通風比是1: 0.4-0.8,pH值為 4. 3-7. 0,發酵時間 8-10h; 3) 發酵罐發酵：種子罐發酵完成后，全部接入發酵罐進行發酵罐發酵，發酵溫度33°C， 轉速 60-100rpm，灌壓 0· 5Mpa，通風比是 1: 0· 4-0. 8,pH值為 4. 3-7. 0,發酵時間 8-10h。
[0011] 其中，芽孢桿菌種子液的制備方法如下： 將所述的芽孢桿菌的單菌落分別接種至MNB培養基中，180rpm，33°C培養12-16h至 0D600為0. 9~1. 1 ;按照1. 0-2. 0%的接種量將制備的一級種子液接種至MNB培養基中， 180rpm，33°C培養 10_12h至 0D600 為 0· 7~1. 0。
[0012] 其中，乳酸菌種子液的制備方法如下： 將所述的乳酸菌的單菌落分別接種至MRS培養基中，37°C培養16-24h至0D600為 0. 8~1 ;將制備好的一級種子液按照1. 0-2. 0%的接種量接種至MRS培養基中，37°C培養 16-20h至 0D600 為 0· 7-1. 0。
[0013] 其中，釀酒酵母種子液的制備方法如下： 將釀酒酵母接種至YH)培養基中，180rpm30°C培養12-16h至0D600為0. 8-1. 0 ;將制 備好的一級種子液按照〇. 5-1. 0%的接種量接種至YH)培養基中，180rpm30°C培養10_12h 至 0D600 為 0· 8-1. 0。
[0014] 其中，種子罐發酵和發酵罐發酵所用培養基含有：種子罐發酵和發酵罐發酵所用 培養基含有：可溶性淀粉5-10g/L;蛋白胨15-20g/L;酵母膏2-4g/L;葡萄糖15-20g/L;磷 酸二氫鉀2-4g/L;氯化鈉3-5g/L;碳酸鈣0. 5-lg/L。
[0015] 本發明所用的枯草芽孢桿菌OfeciWiA? H8-1，其顯著區別于現有的 枯草芽孢桿菌，為申請人從福建蝦高位池池水中分離得到，其生物學特征如下：菌落表面 光滑，半透明，呈污白色，菌落圓形，邊緣成鋸齒狀；菌落形態為桿狀，大小為〇. 8~1. 2X1. 5~4.Oum，芽孢形態為橢圓到柱狀，位于菌體中央或稍偏，芽孢形成后菌體不膨大。
[0016] 本發明中的枯草芽孢桿菌H8-1對濃度為2. 5mg/L的氨氮、亞硝態氮降解率分別為 81. 72%、99. 70%，能有效降解水體的氨氮和/或亞硝態氮水平。與現有的枯草芽孢桿菌區別 于可以在0%。、3%。、15%。鹽濃度條件下均生長良好，可以耐受10-15°C低溫生長良好。本發 明的枯草芽孢桿菌6·?/Ζ7Ζ^76·)Η8_1已于2014年6月18日保藏于中國微生物 菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3 號，中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCCNo. 9356。
[0017] 本發明屎腸球菌分離自豬腸道，并經過紫外誘變篩選獲得。
[0018]屎腸球菌 /aeci·)CGMCCNo. 9134 的特征為： (1)屎腸球菌 /aeciiM?)CGMCCNo. 9134 菌液 80°C處理 5min，存活率為 0. 18%，相對出發菌株提高22倍。
[0019] (2)屎腸球菌/aeci·)CGMCCNo. 9134 菌液用 0· 3% 的豬膽鹽處理 3h，存活率為20. 80%，相對出發菌株提高3. 04倍。
[0020] (3)屎腸球菌/aeci·)CGMCCNo. 9134 菌液用 0· 6% 的豬膽鹽處理 3h，存活率為21. 6%，相對出發菌株提高27. 69倍。
[0021] 將本發明的屎腸球菌新菌株于2014年5月8日保藏于中國微生物菌種保藏管理 委員會普通微生物中心，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究 所，登記號：CGMCCNo. 9134。本發明的屎腸球菌新菌株經過10次以上的傳代培養不退化， 具有遺傳穩定性，且抗逆性遠遠比出發菌株提高很多。
[0022] 本發明的復合微生態制劑的優點和有益效果是：本發明復合微生態制劑中的菌種 都是安全、優良菌種；生長特性不同，菌株間協作共生效應好：芽孢桿菌和酵母菌可為乳酸 菌的生長提供無氧環境，且發酵過程中，不同菌株的代謝過程各異，相互調節共同達到一個 穩態，為發酵液的保存提供了有利條件；不同菌種各司其職，功能全面：芽孢桿菌降解水中 的有害物質、剩余餌料及雜質；乳酸菌產生有機酸，提高養殖動物免疫活性；酵母菌的生長 能夠分解利用碳水化合物合成微生物蛋白，為有益藻生長提供原料；菌種豐富，產品穩定性 好，防污染能力強。
【附圖說明】
[0023] 圖1為EM10發酵液樣品肥水功效測定結果。配制統一肥水功效測定培養基，滅 菌，實驗前同時加入同比例的小球藻液體。在光照條件下，室溫，放置培養72h，培養過程中 每隔4h進行搖晃15次。實驗分為陰性對照組（CK)、陽性對照組（市售產品組）以及試驗 組（EM10組)，重復數為3,EM10和市售產品組接種菌濃度終為105CFU/mL，分別從瓶中取樣 10mL進行葉綠素-a含量的測定，EM10組和市售產品組樣品的葉綠-a含量分別比CK組樣 品葉綠素_a含量提高了 42. 12%和34. 48%。
[0024] 圖2為EM10發酵液樣品亞硝態氮降解率測定結果。起始亞硝氮濃度為2. 5mg/L， 實驗前試驗組添加EM10產品，菌濃度為104CFU/mL;對照