mol)置于50mL圓底燒瓶中，120度攪 拌反應1小時。液相質譜顯示反應完全，將反應液冷卻至室溫，緩慢倒入冰水中，有固體析 出，過濾，濾餅用水（20mL*3)淋洗后得到粗品固體標題化合物，然后再用石油醚（30mL)打 漿得到灰色標題化合物（1. 4g，75% )。
[0380] 1HNMR(400MHz，CDC13)ppmδ8. 29 (d，1H)，8. 02 (d，1H)，7. 74 (dd，1H)，6. 79 (d，1H)， 4. 44 (t, 2H), 2. 90 (dt, 2H).
[0381]c) 7-溴-3-(2-溴乙基）-4H_ 吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮
[0382] 將（E)-3-(((5-溴吡啶-2-基）氨基）亞甲烯基）二氫呋喃-2(3H)_酮 (1. 4g，5. 2mmol)和三溴氧磷（6. 98g，24. 35mmol)置于50mL圓底燒瓶中，80度攪拌反應L5 小時。液相質譜顯示反應完全，將反應液冷卻至室溫，緩慢倒入冰水中，調節pH值到8,用二 氯甲烷（20mL*3)萃取，有機相用飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥，濃縮得到黃色固體狀標 題化合物（L2g，69% )。
[0383]1HNMR(400MHz，CDC13)ppmδ9. 17 (d，1H)，8. 27 (s，1H)，7. 74 (dd，1H)，7. 54 (d，1H)， 3. 73 (t, 2H), 3. 21 (t, 2H).
[0384]d) 7-溴-3- (2-乙基嗎啡啉）-4H-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮
[0385]將 7-溴-3-(2-溴乙基）-4H-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮（0· 2g，0. 6mmol)，嗎啡 啉（78. 73mg，0. 9mmol)和碳酸銫（0. 59g，1. 81mmol)置于50mL圓底燒瓶中，70度攪拌反應 12小時。液相質譜顯示反應完全，將反應液冷卻至室溫，加水，用二氯甲烷（20mL*3)萃取， 有機相用飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥，濃縮得到油狀粗品標題化合物，直接用于下一步 反應。
[0386]e) 2-氯-4-氟-N- (2-甲氧基-5- (3- (2-乙基嗎啡啉）-4-氧代-4H-吡啶并 [1，2-a]嘧啶-7-基）吡啶-3-基）苯磺酰胺
[0387] 將7-溴-3-(2-乙基嗎啡啉）-4H_吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮（0· 59mmol) 溶解在二氧六環（2mL)和水（0. 4mL)中，在氮氣保護下加入2-氯-4-氟-N-(2-甲氧 基-5-(4,4,5,5-四甲基-1，3,2-二雜氧戊硼烷-2-基）批啶-3-基）苯磺酰胺（0. 59mmol)， 碳酸鉀（1.ISmmol)和1，Γ-雙（二苯基磷）二茂鐵氯化鈀（22mg)。將混合物置于微波反 應條件下100度反應1小時。液相質譜顯示反應完全。將反應液過濾濃縮后得到粗品。粗 品用硅膠柱色譜和制備高效液相色譜法純化得到標題產物。
[0388]1HNMR(400MHz，CDC13)ppmδ9. 08 (s，1H)，8. 29 (s，1H)，8. 17-8. 09 (m，2H)，7. 94 (d， 1H)，7· 85-7. 77 (m，1H)，7· 75-7. 68 (m，1H)，7· 28 (d，1H)，7· 18-7. 12 (m，1H)，4· 00 (s，3H)，3· 7 9 (br.s. , 3H), 2. 93 (br.s. , 1H).
[0389] 實驗例1體外酶活性測試
[0390] 本發明所有實施例中對PI3K(pllOc〇激酶活性分別通過以下兩種測試方法進行 測試。
[0391]方法一：
[0392]反應緩沖液：HEPES50mM(ρΗ7· 0)，NaN30. 02 %，BSA0. 01 %，OrthovanadateO.lm M, 1 %DMSO
[0393]Detectionbuffer:HEPES10mM(pH7. 0),BSA0. 02% ,KF0. 16M,EDTA4mM
[0394] 反應用酶：在昆蟲細胞中表達的N-末端帶His標記的人源重組全長PI3Kpi10a 亞基（分子量=128. 4kDa)和不帶標記的p85a亞基（分子量=83. 6kDa)
[0395]反應用底物：10μΜPIP2 底物（PI(4, 5)P2)
[0396]反應條件：10μMPI(4, 5)P2 和 10μMATP
[0397] 反應步驟：
[0398] 1.在新鮮配置的反應液里準備好底物。
[0399] 2.將激酶加入底物反應液中，輕柔地混合。
[0400]3.利用Acoustic技術（Echo550;nanoliterrang)將溶解在 100%DMS0 的化合 物轉移入激酶反應液中，在室溫下孵育10分鐘
[0401] 4.在反應體系中加入合適濃度的ATP。
[0402] 5.30°C孵育半個小時
[0403] 6.加入終止液終止反應。
[0404] 7.加入檢測混合物并孵育過夜。
[0405] 8.利用均相時間分辨熒光（HTRF)方法進行檢測。（激發波長320nm，測量在615nm 和665nm發射波長讀數的比例）。
[0406]方法二：
[0407]ADP-Glo實驗方法
[0408] 化合物稀釋：
[0409] 3倍梯度稀釋待測化合物，共10個濃度點（ΙΟΟΟΟηΜ到0· 5nM)。
[0410] 實驗方法：
[0411] 轉移50nL化合物至反應板（PerkinElmer#6007299)中，加入3uL酶/底物混合物 (0· 33nMPI3Kalpha,Millipore#14-602-K/166. 5uMPIP2)，孵育 20min后加入 2uLATP溶液 (lOOuM)起始反應，室溫反應2小時后，加入5uLADP-Glo試劑終止激酶反應，室溫孵育60 分鐘完全消化剩余未反應ATP，加入10uL激酶檢測試劑，室溫孵育40分鐘后，在Envision 上讀取熒光。PIP2,ATP，ADP-Glo試劑及激酶檢測試劑均來自ADP-Glo激酶檢測試劑盒 (Promega#V1792)〇
[0412] 數據分析：
[0413]采用標準 4 參數擬合法計算IC50 (Model205,XL-fit，iDBS)。
[0414] 本發明所有實施例中對mTOR激酶活性分別通過以下測試方法進行測試。
[0415] 反應緩沖液：20mMΗ印es(pH7. 5)，10mMMgCl2, 2mMMnCl2,ImMEGTA, 0· 02 % Brij35, 0. 02mg/mlBSA, 0.ImMNa3V04, 2mMDTT, 2%DMS0.
[0416] 反應用酶：在昆蟲細胞中表達的N-末端帶GST標記的人源重組mTOR片段（氨基 酸 1360-2549,分子量=163. 9kDa)
[0417] 反應用底物：在細菌中表達的N-末端帶His標記的人源重組全長4EBP1 (分子量 = 13. 6kDa)
[0418]反應條件：3μΜ4ΕΒΡ1 和ΙΟμΜΑΤΡ
[0419] 反應步驟：
[0420]1.在新鮮制備的反應緩沖液中加入反應底物和其它反應因子。
[0421] 2.將激酶加入底物反應液中，輕柔地混合。
[0422] 3.利用Acoustic技術（Echo550;nanoliterrang)將溶解在 100%DMS0 的化合 物轉移入激酶反應液中，在室溫下孵育20分鐘。
[0423] 4.在反應體系中加入合適濃度的32P-ATP。
[0424] 5.室溫中孵育兩個小時。
[0425] 6.利用P81filter-binding方法檢測激酶活性。
[0426] 實驗結果見表3:
[0427] 表3體外酶活性測試結果
[0428]
[0430] 注：A彡ΙηΜ;1ηΜ〈Β彡 50nM;50nM〈C彡 200nM;200nM〈D;NT表示未測。
[0431] 實驗例2體外細胞活性測試
[0432] 實驗步驟和方法：
[0433] 1.將MCF-7細胞以每孔2. 5X104個的密度種進96孔板中（使用的培養液需為含 10%FBS的完整培養液）。
[0434] 2.第二天將孔中的培養液抽走，將某一個濃度（初步篩選）或一系列濃度（IC5。測 試）的化合物溶解在不含血清的培養液中，加入96孔板培養細胞2小時。
[0435] 3.把胰島素溶解在不含血清的培養液中，加入細胞培養30分鐘，胰島素終濃度為 10微克/ _升。
[0436] 4.等待反應時，按如下方法準備裂解液：
[0437]a)增強液（EnhancerSolution)需要提前從冰箱里取出融化。
[0438]b)將增強液（EnhancerSolution)用 5X的裂解緩沖液（LysisBuffer)稀釋 10 倍，制備成濃縮裂解液。
[0439]c)將濃縮裂解液用雙蒸水稀釋5倍，制成裂解液。
[0440] 5.將孔內的培養液吸凈，并用PBS迅速的潤洗一次。
[0441] 6.每個孔加入150微升新鮮制備的裂解液，然后室溫震蕩10分鐘。
[0442] 7.確認所有細胞都已脫落后，將裂解液同細胞碎片一起轉移到1. 5毫升管內。
[0443] 8.渦旋幾次，使裂解液和細胞完全混合，然后將混合液在4°C用12000g離心10分 鐘。
[0444] 9.計算出需要的ELISA-one微板條的數目。把多出的微板條從框架上取下，放回 儲存袋中密封好。使用微板條之前，先用200微升雙蒸水潤洗一下每個孔，以除去上面的防 腐劑。
[0445] 10.往每個孔中加入50微升的抗體混合液。（抗體混合液是通過將媒介抗體試劑 和酶標抗體試劑等比例混合而成，注意制備抗體混合液時不要渦旋）
[0446] 11.向ELISA-One微板的每個孔中加入25微升細胞裂解產物。用粘性封口膜蓋住 微板，室溫下在微板震蕩儀上孵育1小時。
[0447] 12.每個孔用150微升IX清洗緩沖液洗3次。最后一次洗完后，將孔內的清洗緩 沖液抽凈。如果需要，可讓IX清洗緩沖液在微板中停留最長30分鐘，以留出時間準備底物 混合液。
[0448] 13.底物混合液應隨用隨配。向每個孔內加入100微升底物混合液，然后用錫箔紙 封住微板，室溫下在微板震蕩儀上孵育10分鐘。
[0449] 14.向每個孔內加入10微升終止液，然后在微板震蕩儀上稍微（5-10秒）混勻一 下。
[0450] 15.裝配好相應的ELISA-One濾鏡組，讀出熒光信號強度。
[0451] 實驗結果見表4:
[0452] 表4體外細胞活性測試結果
[0453]
[0454]注：A彡 50nM;50nM<B彡ΙΟΟηΜ;100nM<C彡 250nM;D>250nM。
[0455] 結論：本發明化合物對PI3K抑制作用顯著，但對mTOR有較弱的抑制作用。
【主權項】
1.式α)所示化合物或其藥學上可接受的鹽，其中， 可將結構單元替換為Μ. Ε選自任選被R3取代的Q 6烷基、C3 i。環烴基或雜環烴基； L和 Q 中，一個選自-C(Rdl) (Rd2)-、-C( = 0)N(Rd3)-、-N(Rd4)-、-C( = NRd5)-、-S(= 〇) 2N (Rae) _>_S ( = 0) N (Rd7) ->-〇->-S->~C ( = 0) 〇->~C ( = 0) ->-C ( = S) ->-S ( = 0) ->-S (= 0) 2-或-N (Rds) C ( = 0) N (Rd9)-，另一個選自單鍵或-c (Rdl) (Rd2)-; A、T分別獨立地選自N或C (Rt); X、Y、Z中的0或1個選自N，其余選自C(Rt); B 選自-C (Rdl) (Rd2) -、-C ( = 0) N (Rd3) -、-N (Rd4) -、-C ( = NRd5) -、-S ( = 0) 2N (Rd6) -、-S (= 〇) N (Rd7)_、_0_、_S -、-C ( = 0) 0-、-C ( = 0) -、-C ( = S) ? ( = 0) ? ( = 0) 2-或-N (Rd8) C( = 〇)N(Rdg)-； 雜原子或雜原子團分別獨立地選自-C( = 0)N(Rd3)-、-N(Rd4)-、-C( = NRd5)-、-S(= 〇) 2N (Rae) _>_S ( = 0) N (Rd7) ->-〇->-S->~C ( = 0) 〇->~C ( = 0) ->-C ( = S) ->-S ( = 0) ->-S (= 〇)2_ 和 / 或 _N(Rds)C( = 0)N(Rd9)-; 1?分別獨立地選自0、1、2或3 ; R13 中的一個選自其余選自 H、F、Cl、Br、I、CN、0H、SH、NH2、 CHO、COOH，或選自任選被RM取代的Q i。烷基或雜烷基、C3 i。環烴基或雜環烴基、被C3 i。環 煙基或雜環煙基取代的G i。烷基或雜烷基； Di 選自單鍵、_C(Rdl) (Rd2)-、-C( = 0)N(Rd3)-、-N(Rd4)-、-C( = NRd5)-、-S(= 〇) 2N (Rae) _>_S ( = 0) N (Rd7) ->-〇->-S->~C ( = 0) 〇->~C ( = 0) ->-C ( = S) ->-S ( = 0) ->-S (= 0)2-或-N(Rds)C( = 0)N(Rd9)-; D2 選自 _C(Rdl) (Rd2)_; D3 選自-N (Rd4) -、-C ( = 0) N (Rd4) -、-N (Rd4) C ( = 0) -、-N (Rd4) C ( = 0) 0-、-N (Rd4) 0C (= 〇)-、_N(Rd4)C( = 0)N(Rd4)-、-S( = 0)-、-S( = 0)2-、-S( = 0)2N(Rd6)-、-S( = 0)N(Rd7)-; R4選自H，或選自任選被RM取代的Q i。烷基或雜烷基、C3 i。環烴基或雜環烴基、被C3 1(] 環煙基或雜環煙基取代的G i。烷基或雜烷基； η 選自 1、2、3、4、5 或 6 ; 任選地，任意兩個&之間、同一個D2中的Rdl與Rd2之間、兩個D 2之間、R4與一個D2之 間或者R4與D3之間共同連接到同一碳原子或雜原子上形成一個或兩個3、4、5或6元碳環 或雜環； Rt、Rdi、Rd2 分別獨立地選自 H、F、Cl、Br、I、CN、0H、SH、NH2、CH0、C00H、C( = 0)NH2、S(= 0) NH2、S ( = 0) 2NH2，或選自任選被RM取代的Q 1(]烷基或雜烷基、C3 1(]環烴基或雜環烴基、 被C3 i。環煙基或雜環煙基取代的g i。烷基或雜烷基； R01 選自 F、Cl、Br、I、CN、OH、SH、NH2、CHO、C00H、R02 ; RD2選自Ci 1(]烷基、Ci i。烷氨基、N，N-二（Ci 1(]烷基）氨基、Ci i。烷氧基、Ci i。烷酰基、 G i。燒氧撰基、Q i。烷基橫醜基、Q i。烷基亞橫醜基、C3 i。環烷基、C3 i。環燒氣基、C3 i。雜環 燒氨1基、C3 i。環烷氧基、C3 i。環烷基醜基、C3 i。環燒氧撰基、C3 i。環烷基橫醜基、C3 i。環烷基 亞磺酰基、5-6元不飽和雜環基、6-12元芳基或雜芳基； 雜原子或雜原子團分別獨立地選自-C( = 0)N(Rd3)-、-N(Rd4)-、-C( = NRd5)-、-S(= 〇)2N(Rd6)-、_S( = 0)N(Rd7)-、-0-、-S-、= 0、= S、-C( = 0)0-、-C( = 0)-、-C( = S)-、-S(= 0)-、-S( = 0)2-和 / 或-N(Rds)C( = 0)N(Rd9)-; Rd3-d9分別獨立地選自H、OH、NH2、R02 ; RD2任選地被RDD1取代； R001 選自 F、Cl、Br、I、CN、OH、N (CH3) 2、NH (CH3)、NH2、CH0、C00H、三氟甲基、氨甲基、羥甲 基、甲基、甲氧基、甲酰基、甲氧羰基、甲磺酰基、甲基亞磺酰基； RM、RM1、雜原子或雜原子團的數目分別獨立地選自〇、1、2或3。2.根據權利要求1所述的式（I)所示化合物或其藥學上可接受的鹽，其中，E選自 被私取代的C16烷基或C36環烷基，R3的數目選自0、1、2或3,或者E選自I其中， Gp5中的〇、l、2或3個選自N，其余選自C(R3); G6 選自 _C (R3) (R3) -、-C ( = 0) N (R3a) -、-N (R3a) -、-C ( = NRJ -、-S ( = 0) 2N (R3a) -、-S (= 〇) N (R3a)_、_〇_、_S -、-C ( = 0) 0-、-C ( = 0) -、-C ( = S) ? ( = 0) ? ( = 0) 2-或-N (R3a) C( = 0)N(R3a)-； G7~9中的0、1或2個選自N，其余選自C(R3); G1Q~16中的0、1、2、3或4個選自N，其余選自C(R3); G17選自N或者C(R3); G18~22 中的 〇、l、2 或 3 個選自-C( = 0)N(R3a)-、-N(R3a)-、-C( = NR3a)-、-S(= 0) 2N (R3a) ->~S ( = 0) N (R3a) ->-〇->-S->~C ( = 0) 〇->-C ( = 0) ->-C ( = S) ->-S ( = 0) ->-S (= 0) 2-或-N (R3a) C ( = 0) N (R3a)-，其余選自-c (R3) (R3)-; R3a選自Q i。烷基、Q i。烷基酰基、Q i。烷氧羰基、Q i。烷基磺酰基、Q i。烷基亞磺酰基、 C3 i。環烷基、C3 i。環烷基酰基、C3 i。環烷氧羰基、C3 i。環烷基磺酰基、C3 i。環烷基亞磺酰基、 5-6元不飽和雜環基、6-10元芳基或雜芳基； 其余變量如權利要求1所定義。3. 根據權利要求2所述的式（I)所示化合物或其藥學上可 接受的鹽，其中，E選自任選被R3取代的甲基、乙基、丙基、)4. 根據權利要求3所述的式（I)所示化合物或其藥學上可接受的鹽，其中，E選自V>5.根據權利要求1所述的式（I)所示化合物或其藥學上可接受的鹽，其中，L和Q中， 一個選自-S ( = 0) 2NH-、-S ( = 0) 2_、-NH-、-NHC ( = 0) NH-，另一個選自單鍵、-CH2-。6. 根據權利要求1所述的式（I)所示化合物或其藥學上可接受的鹽，其中，X、Y、Z中 的 0 或 1 個選自 N，其余選自 CH、C (CH3)、C (CF3)、CC1、CF。7. 根據權利要求1所述的式（I)所示化合物或其藥學上可接受的鹽，其中，A、T分別獨 立地選自 N、CH、C (CH3)、C (CF3)、CC1、CF ;或者，B 選自 NH、N (CH3)或 N (CF3)。8. 根據權利要求1所述的式（I)所示化合物或其藥學上可接受的鹽，其中，任意兩個 札之間、同一個D2中的R dl與Rd2之間、兩個D2之間、R4與一個D2之間或者R 4與D3之間所 成的環選自：9. 根據權利要求1所沭的式（I)所示化合物或其藥學上可接受的鹽，其中，& 3中的 一個選自 其余選自 H、F、Cl、Br、I、CN、OH、SH、NH2、CHO、COOH、 > 0Ra、N(Rb) (RJ、任選被Rd取代的Q 3烷基或環丙基A選自單鍵、-C(RJ (RJ-、-C( = 0) N(Ra)-、-N(Ra)-、-C( = NRa)-、-S( = 0)2N(Ra)-、-S( = 0)N(Ra)-、-0-、-S-、-C( = 0) 0-、-C( = 0)-、-C( = S)-、-S( = 0)-、-S( = 0)2-或-N(Ra)C( = 0)N(Ra)_ ;D2 選自-C(Ra) (Ra)_ ； n 選自 1、2、3、4、5 或 6 ; Ra、Rb、R。分別獨立地選自H、任選Rd取代的Q 6烷基或C3 6環烷基； I選自Η、任選Rd取代的G 6烷基或烷氧基、任選Rd取代的C3 6環烷基或環烷氧基； Rd 選自 F、Cl、Br、I、CN、OH、NH2、CHO、C00H、CH3、CF3、CH 30、CH3CH20, Rd 的數目選自 0、1、 2或3 ; 任選地，任意兩個&之間、同一個D2中的Ra與Ra之間、兩個D 2之間、或Ra與一個D2之 間共同連接到同一碳原子或氧原子上形成一個或兩個3、4、5或6元碳環或氧雜環，其中氧 原子的數目為1或2。10. 根據權利要求9所述的式（I)所示化合物或其藥學上可接受的鹽，其中，任意兩個 札之間、同一個D2中的R a與Ra之間、兩個D2之間、或Ra與一個D2之間所成的環選自環丙 基、環丁基、環戊基、環己基、氧雜環丁基、1，3-二氧五環基。11. 根據權利要求1~10任意一項所述的式（I)所示化合物或其藥學上可接受的 鹽，其中，R13中的一個選自 ▼. 、y . V其余選自H、F、Cl、Br、I、CN、0H、NH2、甲基、乙基、丙基、甲氧 基、乙氧基、甲氨基、二甲氨基、鹵代甲基、鹵代乙基、鹵代丙基、氨甲基、氨乙基、氨丙基、環 丙基。12. 根據權利要求1所述的式（I)所示化合物或其藥學上可接受的鹽，其選自：
【專利摘要】本發明公開了一類作為PI3K抑制劑的吡啶并[1,2-a]嘧啶酮類似物，具體地，本發明涉及式(I)所示化合物或其藥學上可接受的鹽。
【IPC分類】A61K31/519, A61P35/00, A61K31/5377, C07D471/04, C07D519/00
【公開號】CN105461711
【申請號】CN201410271282
【發明人】吳成德, 于濤, 陳曙輝
【申請人】南京明德新藥研發股份有限公司
【公開日】2016年4月6日
【申請日】2014年6月17日