劃分的樣品接觸檢測試劑。
[0098]盤
[0099]樣品可被劃分為多個劃分產(chǎn)物。劃分產(chǎn)物可包括多種類型的劃分產(chǎn)物中的任一種，包括固體劃分產(chǎn)物(如孔或管)和流體劃分產(chǎn)物(如油相內(nèi)的水性液滴)。在一些實施方式中，這些劃分產(chǎn)物是液滴。在一些實施方式中，這些劃分產(chǎn)物是微通道。劃分樣品的方法和組合物描述于，例如，公開的專利申請WO 2010/036352,US 2010/0173394,US 2011/0092373和US 2011/0092376，其各自通過引用全文納入本文。
[0100]在一些情況中，劃分樣品并將檢測試劑(如探針)摻入至劃分的樣品中。在其他情況中，使樣品接觸檢測試劑并隨后劃分樣品。在一些實施方式中，各試劑(如探針、引物、緩沖劑、酶、底物、核苷酸、鹽等)在劃分前混合在一起，隨后劃分樣品。在一些情況中，在將各試劑混合在一起后立即劃分樣品，使得基本所有或大部分反應(yīng)(如逆轉(zhuǎn)錄、DNA擴增、DNA切割等)在劃分后發(fā)生。在其它情況中，在反應(yīng)進行緩慢或完全不進行的溫度下混合試劑，然后劃分樣品，并且調(diào)節(jié)反應(yīng)溫度以使反應(yīng)進行。例如，可在冰上、低于51、或0、1、2、3、4、5、
6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、20-25、25-30或30-35°(3或更高溫度下合并試劑。一般而言，本領(lǐng)域技術(shù)人員會知曉如何選擇一種或多種反應(yīng)受到抑制的溫度。在一些示例中，采用溫度和時間的組合以避免劃分之前的明顯反應(yīng)。
[0101 ]此外，可使用一種或多種熱啟動酶(例如熱啟動逆轉(zhuǎn)錄酶或熱啟動DNA聚合酶)混合試劑和樣品。因此，可混合樣品和緩沖劑、鹽、核苷酸、探針、標記物、酶等中的一種或多種并隨后進行劃分。隨后，由熱啟動酶催化的反應(yīng)可通過加熱混合物劃分產(chǎn)物以激活一種或多種熱啟動酶來起始。
[0102]此外，可在不存在起始打算的反應(yīng)(如逆轉(zhuǎn)錄或DNA擴增)所需的一種或多種試劑的情況下將樣品和試劑(例如緩沖劑、鹽、核苷酸、探針、標記物、酶等中的一種或多種)混合在一起?；旌衔锶缓罂杀粍澐殖梢唤M第一混合物劃分產(chǎn)物中，然后可通過融合這組第一混合物劃分產(chǎn)物和提供必要試劑的一組第二混合物劃分產(chǎn)物來提供一種或多種必要試劑。或者，可向第一混合物劃分產(chǎn)物中加入必要試劑，而不形成第二混合物劃分產(chǎn)物。例如，必要試劑可分散到這組第一混合物劃分產(chǎn)物油包水液滴中。作為另一個示例，缺失的試劑可被導(dǎo)向含有這組第一混合物劃分產(chǎn)物的一組微通道中。
[0103]在一些實施方式中，將樣品劃分成多個液滴。在一些實施方式中，液滴包含乳液組合物，即不互溶的流體(如水和油)的混合物。在一些實施方式中，液滴是水性液滴，其被不互溶的運載體流體(如油)包圍。在一些實施方式中，液滴是油性液滴，其被不互溶的運載體流體(如水性溶液)包圍。在一些實施方式中，本文所述液滴是相對穩(wěn)定的并在兩個或更多個液滴之間具有最小聚結(jié)。在一些實施方式中，由樣品生成的液滴中不到0.0001 %、0.0005%、0.001%、0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%與其他液滴聚結(jié)。這些乳液還可具有有限的絮凝，一種分散相以薄片從懸浮液中產(chǎn)生的過程。
[0104]在一些實施方式中，使油相流過包含待檢測核酸的水性樣品，從而形成液滴。在一些實施方式中，包含待檢測核酸的水性樣品還包含緩沖的溶液和一種或多種用于檢測核酸的序列特異性檢測試劑。
[0105]該油相可包含氟化基礎(chǔ)油，其可通過與氟化表面活性劑(如全氟聚醚)聯(lián)用而進一步穩(wěn)定。在一些實施方式中，該基礎(chǔ)油包括以下一種或多種:HFE7500、FC-40、FC-43、FC-70或另一種常見氟化油。在一些實施方式中，該油相包含陰離子含氟表面活性劑。在一些實施方式中，該陰離子含氟表面活性劑是Ammonium Krytox(Krytox-AS)、Krytox FSH的錢鹽或Krytox FSH的嗎啉基衍生物。Krytox-AS的濃度可以是約0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%、2.0%、3.0%或4.0%(￥/^)。在一些實施方式中，Krytox-AS的濃度是約1.8%。在一些實施方式中，Krytox_AS的濃度是約1.62% 0Krytox?3!1的嗎啉基衍生物的濃度可以是約0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%、2.0%、3.0%或4.0% (w/w)。在一些實施方式中，Krytox FSH的嗎啉基衍生物的濃度是約1.8%。在一些實施方式中，Krytox FSH的嗎啉基衍生物的濃度是約1.62%。
[0106]在一些實施方式中，該油相還包含用于調(diào)節(jié)油性質(zhì)(如蒸氣壓、粘性或表面張力)的添加劑。非限制性示例包括全氟辛醇和1!1，1!1，2!1，2!1-全氟癸醇。在一些實施方式中，1!1，1!1，2!1，2!1-全氟癸醇以約0.05%、0.06%、0.07%、0.08%、0.09%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%、1.25%、1.50%、1.75%、2.0%、2.25%、2.5%、2.75%或3.0%(?/?)的濃度添加。在一些實施方式中，1!1，1!1，2!1，2!1-全氟癸醇以約0.18% (w/w)的濃度添加。
[0107]在一些實施方式中，該乳液配制為生成具有類液界面膜的高度單分散液滴，其可通過加熱轉(zhuǎn)化為具有類固界面膜的微膠囊;這類微膠囊可作為生物反應(yīng)器以通過一段時間的孵育保持其含量。轉(zhuǎn)化為微膠囊形式可在一經(jīng)加熱后即發(fā)生。例如，這類轉(zhuǎn)化可發(fā)生于超過約40°、50°、60°、70°、80°、90°或95°C的溫度下。加熱過程期間，流體或礦物油覆蓋物可用于阻止蒸發(fā)。過量的連續(xù)相油可在加熱前除去。這些微膠囊可在大范圍的熱和機械處理下抗聚結(jié)和/或絮凝。
[0108]轉(zhuǎn)化后，這些微膠囊可儲存于約-70°、-20。、0。、3°、4°、5°、6°、7°、8°、9°、10°、15°、20°、25°、30°、35°或40°C下。在一些實施方式中，這些微膠囊可用于儲存或運輸混合物劃分產(chǎn)物。例如，可在一個位置處收集樣品，劃分為含有酶、緩沖劑和/或引物的液滴中，任選地可進行一個或多個逆轉(zhuǎn)錄、擴增或連接反應(yīng)，然后可加熱該劃分產(chǎn)物以進行微囊化，并且可儲存或運輸微膠囊用于進一步分析。
[0109]這些微膠囊劃分產(chǎn)物可含有一種或多種序列特異性或非特異性檢測試劑并可抗聚結(jié)，特別是在高溫下。因此，這些膠囊可在非常高的密度(例如每單位體積的劃分產(chǎn)物數(shù))下孵育。在一些實施方式中，可每毫升孵育超過100000、500000、1000000、1500000、2000000、2500000、5000000或10000000個劃分產(chǎn)物。在一些實施方式中，樣品-探針孵育發(fā)生在單個孔中，例如微量滴定板的孔，此時各劃分產(chǎn)物之間沒有內(nèi)部混合。這些微膠囊還可含有孵育所需的其他組分。
[0110]在一些實施方式中，將樣品劃分成至少500個劃分產(chǎn)物、至少1000個劃分產(chǎn)物、至少2000個劃分產(chǎn)物、至少3000個劃分產(chǎn)物、至少4000個劃分產(chǎn)物、至少5000個劃分產(chǎn)物、至少6000個劃分產(chǎn)物、至少7000個劃分產(chǎn)物、至少8000個劃分產(chǎn)物、至少10,000個劃分產(chǎn)物、至少15,000個劃分產(chǎn)物、至少20,000個劃分產(chǎn)物、至少30,000個劃分產(chǎn)物、至少40,000個劃分產(chǎn)物、至少50，000個劃分產(chǎn)物、至少60，000個劃分產(chǎn)物、至少70，000個劃分產(chǎn)物、至少80，OOO個劃分產(chǎn)物、至少90 ,OOO個劃分產(chǎn)物、至少100 ,OOO個劃分產(chǎn)物、至少200 ,OOO個劃分產(chǎn)物、至少300，000個劃分產(chǎn)物、至少400，000個劃分產(chǎn)物、至少500，000個劃分產(chǎn)物、至少600，000個劃分產(chǎn)物、至少700 ,OOO個劃分產(chǎn)物、至少800 ,OOO個劃分產(chǎn)物、至少900 ,OOO個劃分產(chǎn)物、至少1,000，000個劃分產(chǎn)物、至少2，000，000個劃分產(chǎn)物、至少3，000，000個劃分產(chǎn)物、至少4，000，000個劃分產(chǎn)物、至少5，000,000個劃分產(chǎn)物、至少10，000，000個劃分產(chǎn)物、至少20，000，000個劃分產(chǎn)物、至少30，000，000個劃分產(chǎn)物、至少40，000，000個劃分產(chǎn)物、至少50，000，000個劃分產(chǎn)物、至少60，000，000個劃分產(chǎn)物、至少70，000，000個劃分產(chǎn)物、至少80，000，000個劃分產(chǎn)物、至少90，000，000個劃分產(chǎn)物、至少100，000，000個劃分產(chǎn)物、至少150，000，000個劃分產(chǎn)物或至少200，000，000個劃分產(chǎn)物。
[0111]在一些實施方式中，該樣品被劃分為足量的劃分產(chǎn)物，使得至少大部分劃分產(chǎn)物具有不超過1個靶核酸(例如不超過約0.1、0.2、0.3、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個靶核酸)。在一些實施方式中，該樣品被劃分為使得一種革G核酸以高拷貝數(shù)/劃分產(chǎn)物存在，而另一靶核酸以少量拷貝數(shù)/劃分產(chǎn)物存在。例如，一種靶核酸可以是以約1、2、3、5、6、8、10、12、
14、15、20、25、30、50或更多個拷貝/劃分產(chǎn)物存在的野生型序列。以少量拷貝數(shù)/劃分產(chǎn)物存在的靶核酸可以是以少于劃分產(chǎn)物的約10%、5%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%、0.005%、0.001%、0.0005%、0.00001%或更少存在的突變、多態(tài)性或稀有序列變體。在一些實施方式中，該樣品被劃分為足量的劃分產(chǎn)物，使得至少大部分劃分產(chǎn)物具有不超過5-10個靶和/或非靶核酸(例如不超過約0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個靶和/或非靶核酸)。在一些實施方式中，大部分劃分產(chǎn)物具有不超過5-10個(例如不超過約0.5、1、2、3、4、5、6、
7、8、9或10個)待檢測核酸。在一些實施方式中，各劃分產(chǎn)物中存在平均約0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2、3、4或5個序列特異性檢測試劑分子。
[0112]在一些實施方式中，生成的液滴在形狀和/或尺寸方面基本均勻。例如，在一些實施方式中，這些液滴在平均直徑方面基本均勻。在一些實施方式中，生成的液滴的平均直徑為約0.001微米、約0.005微米、約0.01微米、約0.05微米、約0.1微米、約0.5微米、約I微米、約5微米、約1微米、約20微米、約30微米、約40微米、約50微米、約60微米、約70微米、約80微米、約90微米、約100微米、約150微米、約200微米、約300微米、約400微米、約500微米、約600微米、約700微米、約800微米、約900微米或約1000微米。在一些實施方式中，生成的液滴的平均直徑為小于約1000微米、小于約900微米、小于約800微米、小于約700微米、小于約600微米、小于約500微米、小于約400微米、小于約300微米、小于約200微米、小于約100微米、小于約50微米，或小于約25微米。在一些實施方式中，生成的液滴在形狀和/或尺寸方面是不均勻的。
[0113]在一些實施方式中，生成的液滴在體積上基本均勻。例如，液體體積的標準偏差可以低于約I皮升、5皮升、10皮升、100皮升、InL或低于約10nL。在一些示例中，液滴體積的標準偏差可低于平均液滴體積的約10-25%。在一些實施方式中，生成的液滴的平均體積為約
0.0011^、約0.0051^、約0.01乩、約0.02乩、約0.03乩、約0.041^、約0.05乩、約0.06乩、約
0.07nLj々0.08nLj々0.09nLj々0.1nLj々0.2nLj々0.3nLj々0.4nLj々0.5nLj々0.6nL、^t0.7nL、約0.8nL、約0.9nL、約 InL、約 I.5nL、約2nL、約2.5nL、約3nL、約3.5nL、約4nL、約
4.5nL、約5nL、約5.5nL、約6nL、約6.5]11^、約711]^、約7.5nL、約8nL、約8.5nL、約9nL、約9.5nL、約10nL、約llnL、約12nL、約13nL、約14nL、約15nL、約16nL、約17nL、約18nL、約19nL、約20nL、約 25nL、約 30nL、約 35nL、約 40nL、約 45nL 或約 50nL。
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